C. — Coloration

Les méthodes de coloration reposent toutes sur la propriété d’absorption et de sélection qu’exerce le protoplasma différencié dans les tissus, sur les diverses matières colorantes dans lesquelles on le plonge.

Pendant longtemps, on a admis que le protoplasma vivant ne se colorait pas, et on peut, en effet, conserver pendant des journées des infusoires ou autres protozoaires vivants dans une solution de carmin ou de picro-carmin sans qu’ils admettent la moindre trace de matière colorante. On a reconnu toutefois dans ces dernières années que cette incapacité du protoplasma à se combiner avec les couleurs n’était pas si générale qu’on l’avait cru tout d’abord. Certaines couleurs d'aniline, le brun de Bismarck' et le bleu de quinoléine entre autres, donnent une coloration diffuse mais persistante aux organismes entiers aussi bien qu’aux tissus vivants. Si on plonge une Anoclonta , par exemple, dans une solution de brun de Bismarck parfaitement neutre, la solution se décolore peu à peu, tandis que tous les tissus de l’animal se teintent vivement en brun, sans que celui-ci paraisse en souffrir. Il en est de même selon Brandt, Henneguy, des infusoires, des rhizopodes. Si, comme l’a fait le dernier de ces auteurs, nous injectons sous la peau du dos d’une grenouille une forte dose de brun de Bismarck, nous constaterons qu’au bout de quelques heures les tissus se teintent uniformément en jaune foncé, surtout le tissu musculaire, et cela sans incommoder du tout la grenouille. Des alevins de truite placés dans une même solution se colorent rapidement, tout en continuant à nager.

Cette coloration des animaux à l’état de vie étant diffuse et générale, ne peut guère rendre service à l’anatomiste. Cependant, selon Brandt, la solution aqueuse d'hématoxyline colore surtout les noyaux des protozoaires vivants. C’est donc, en général, sur les tissus morts, frais ou durcis, que l’on opère. Pour les objets de grand volume, la matière colorante ne pénétrant pas facilement, on en fera des coupes que l’on colorera ultérieurement; ceux, au contraire qui sont de petit volume, seront colorés en bloc.

Carmin. — Les solutions de cette substance s’emploient sous les formes les plus diverses pour obtenir la coloration des noyaux cellulaires. Nous énumérerons sous ce titre les principales de ces solutions, celles que nous employons dans notre laboratoire, en indiquant la manière de les préparer.

Carmin neutre renfermant 100 parties d’eau, 1 partie d’ammoniaque, 1 partie de carmin. On commence par dissoudre 1(' carmin

GENERALITES SUR LA TECHNIQUE

dans l’ammoniaque additionnée d’un peu d’eau, puis on ajoute le reste de ce dernier liquide. S’il y a un excès d’ammoniaque, on le chasse en chauffant la solution sur le bain-marie jusqu’à ce qu’il commence à se former un précipité de carmin. On laisse refroidir, puis on filtre. A ce degré de concentration, les colorations sont assez rapides; si les tissus séjournent trop longtemps dans la solution, ils se surcolorent en entier, et la teinte est diffuse. En règle générale, on préférera, pour obtenir une jolie coloration, bien régulière, employer une solution plus diluée, agissant pendant un temps plus long. Lorsque la coloration aura été poussée trop loin, on pourra l’atténuer en lavant le tissu dans de l’eau aiguisée d’une goutte d’ammoniaque; toutefois, ce lavage provoquant souvent la diffusion du carmin, il est préférable, en tous cas, d’obtenir tout de suite une bonne coloration.

Pour les tissus qui ont séjourné dans l’acide chromique ou le bichromate de potasse, Ranvier conseille de les débarrasser de l’excès d’acide chromique par un séjour dans l’eau de vingt-quatre à quarante-huit heures, et en plongeant ensuite la pièce dans l’alcool ou dans un mélange d’alcool et d’acide acétique, puis reprenant par l’eau et soumettant à la coloration au carmin; sans cette précaution, on n’obtient pas la coloration des noyaux cellulaires.

La coloration lente, préférable, comme nous l’avons dit, pour les pièces à l’alcool, ne l’est pas pour celles qui ont séjourné dans l’acide picrique. La coloration est longue et difficile pour les objets traités à l’acide osmique, mais l’élection se fait sur les mêmes éléments qu’après l’action de l’alcool, et à ce point de vue, l’acide osmique diffère complètement de l’acide chromique qui, comme nous venons de le dire, ne permet pas au carmin de colorer les noyaux des cellules (Ranvier).

Les objets colorés doivent être soigneusement lavés avant d’être traités ultérieurement.

Carmin glycérine de Beale , très employé pour colorer les noyaux des protozoaires après leur fixation à l’acide osmique ou à l’acide chromique. Il renferme :

Eau distillée 60 grammes,

Glycérine 60 —

Alcool 15 —

Ammoniaque 3, 5 —

Carmin * 0,64 —

Le carmin pulvérisé est placé dans l’ammoniaque. Lorsque sa dissolution est opérée, on ajoute l’eau, la glycérine et l’alcool en agitant le liquide que l’on filtre quelques heures après.

COLORATION

Carmin acétique de Schneider . — Se localise parfaitement sur les noyaux et éclaircit considérablement les éléments. On le prépare en saturant de carmin une solution à 45 pour 100 d’acide acétique bouillant, qui est la proportion sous laquelle celui-ci dissout le plus de carmin. Puis l'on filtre, pour séparer l’excès de carmin.

Carmin oxalique de Thiersch . — En voici la formule, telle que la donne Ranvier :

Carmin 1

Ammoniaque 1

Eau 3

Acide oxalique 1 i ~

Eau 22 ^

Alcool absolu 12

On fait un premier mélange de carmin, d’ammoniaque et d’eau, dans les proportions indiquées, et un second mélange d’acide oxalique et d’eau; on prend huit parties de ce second mélange pour une du premier, et l’on ajoute au tout douze parties d’alcool absolu. Quand il se fait un précipité, on ajoute quelques gouttes d’ammoniaque.

Carmin alunique (Grenacher). — On le prépare en dissolvant à chaud, pendant dix à vingt minutes, du carmin pulvérisé dans une solution aqueuse de 1 à 5 pour 100 d’alun ordinaire ou d’alun ammoniacal, puis on filtre. Cette matière colorante est très intense, elle présente cependant l’avantage de ne pas surcolorer le tissu, on peut l’y laisser longtemps sans que la couleur qui est plutôt lilas que rouge ne change.

Carmin boracique (Grenacher). — On dissout à la température de l’ébullition 1 à 2 pour 100 de borax dans l’eau distillée avec 1/2 à 3/4 pour 100 de carmin. On obtient de cette manière une solution couleur pourpre que l’on filtre si elle n’est pas claire et à laquelle on ajoute goutte à goutte, avec précaution, de l’acide acétique jusqu’à ce que la couleur passe au rouge pur, c’est-à-dire à la couleur de la solution ordinaire du carmin. On laisse reposer vingt-quatre heures, puis on filtre de nouveau. La solution appliquée telle quelle donne une coloration diffuse. Pour obtenir la coloration des noyaux on lave la coupe à l’eau, puis on la transporte dans un verre de montre contenant de l’alcool de 50 à 70 pour 100, et une goutte d acide chlorhydrique. La substance colorante se dissout de nouveau et pénètre dans la préparation en peu de temps. C’est un procédé excellent pour colorer rapidement et très strictement les noyaux, mais il n’est applicable qu’aux coupes. Pour teindre des animaux

GENERALITES SUR LA TECHNIQUE

entiers, Grenadier conseille l’emploi d’une solution de 2 à 3 pour 100 de carmin dans du borax à 4 pour 100, à laquelle on ajoute à peu près le même volume d’alcool à 70 pour 100. On y laisse les pièces jusqu’à ce qu’elles soient complètement pénétrées, puis on les lave dans de l’alcool avec de l’acide chlorhydrique (quatre à six gouttes sur 100 centimètres cubes).

Picro-carminate d’ammoniaque. — Ce réactif universellement employé, doit être préparé de la manière suivante selon Ranvier : « On verse dans une solution saturée d’acide picrique du carmin dissous dans l’ammoniaque jusqu’à saturation, puis on évapore dans une étuve. Après réduction des quatre cinquièmes, la liqueur refroidie abandonne un dépôt peu riche en carmin qui est séparé par filtration. Les eaux mères évaporées donnent le picrocarminate solide sous la forme d’une poudre cristalline de la couleur de l’ocre rouge. Cette poudre doit se dissoudre entièrement dans l'eau distillée. On en fait une solution au centième. »

Les objets placés dans cette solution prennent la double coloration rouge du carmin, et jaune de l’acide picrique; on peut faire disparaître cette dernière par un lavage prolongé dans l’eau distillée. La double coloration devient plus précise si on lave l’objet dans de l’alcool additionné d'une goutte d’acide chlorhydrique, après l’action du picro-carminate.

Teinture de cochenille (Paul Mayer). — L’emploi de cette teinture, qui donne une couleur plus ou moins semblable à celle du carmin, se recommande dans les cas où les autres matières colorantes ne sont pas suffisamment pénétrantes, pour les animaux à chitine en particulier. On la prépare en dissolvant de la cochenille dans l'alcool à 70 pour 100 pendant quelques jours (1 gramme de matière colorante pour 8 à 10 centimètres cubes d’alcool environ). Après filtration, le liquide passe très clair et d’un beau rouge. On peut l’employer tel quel en le faisant agir sur les objets préalablement traités par l’alcool à 70 pour 100. Au bout de quelques minutes, les coupes et les petits objets y seront suffisamment colorés. Pour les coupes, on peut ralentir l’action de la cochenille en y ajoutant de l’eau. Dans le cas où il y aurait surcoloration, on traite l’objet par l’alcool à 70 pour 100 jusqu’à ce qu’il n’enlève plus de matière colorante, le même alcool employé à chaud décolore encore plus rapidement. Les noyaux et le protoplasma sont fortement teints.

L’alcool à 90 pour 100 et l’alcool absolu dissolvent aussi la cochemille, mais en moindre proportion que celui à 70 pour 100, et les solutions en sont trop claires pour être utilement employées. L’action des acides sur la cochenille fait tourner la couleur au jaune.

COLORATION

l’ammoniaque et les autres alcalis caustiques changent la teinte carmin en pourpre. Les sels métalliques produisent des précipités bleuâtres, brunâtres, verdâtres qui peuvent être utilisés. Si on ajoute, par exemple, à un tissu déjà coloré par la teinture de cochenille, une dissolution d’un sel de fer ou do chaux dans l’alcool, le rouge cochenille passe au bleu foncé. Ce changement de couleur se produit quelquefois spontanément, par le fait des sels qui se trouvent normalement dans l’organisme vivant, et il est difficile alors de distinguer le bleu violacé de la cochenille de celui de l’hématoxyline . dont nous allons parler.

Les objets conservés dans les combinaisons de chrome ou d’acide picrique se colorent très bien avec la cochenille.

Hématoxyline. — Cette substance colorante est retirée du bois de campêche. On la trouve dans le commerce en masses cristallines rose brunâtre. Voici comment on l’emploie en histologie.

On dissout 0 gr. 35 d’hématoxyline dans 10 grammes d’alcool absolu, puis 0 gr. 10 d’alun dans 30 grammes d’eau distillée. On verse 'quelques gouttes de la première solution dans la seconde jusqu’à ce qu’on ait obtenu un liquide d’un beau violet. Son pouvoir colorant est très grand, et les petits objets ne doivent y séjourner que quelques minutes ; à la longue, cette coloration pâlit, même dans le baume de Canada. La solution d’hématoxyline se décompose facilement et donne ordinairement asile à des champignons, en sorte qu’il est bon de la préparer fraîche à mesure que l’on doit s’en servir.

Kleinenberg obtient une coloration plus complète des noyaux en préparant l’hématoxyline comme suit : On fait une solution concentrée de chlorure de calcium dans l’alcool à 70 pour 100, à laquelle on ajoute de l’alun jusqu’à saturation; puis, pour une partie de cette solution, on ajoute six à huit parties d’alcool à 70 pour 100, et une quantité indéterminée, d’autant plus grande que l’on veut une matière colorante plus intense, de la solution d’hématoxyline dans l’alcool absolu. Après la coloration, les objets sont lavés dans l’alcool à 90 pour 100.

Pour les petits animaux, il vaut mieux employer une dissolution faible en hématoxyline, la coloration est plus lente, mais plus régulière. Si le liquide est trop concentré, il ne faut pas l’éclaircir avec l’alcool qui précipite l’hématoxyline, mais avec la solution d’alun et de chlorure de calcium. Dans le cas où l’objet est trop coloré, on le lave dans de l’alcool acidulé d’acide oxalique (Kleinenberg) ou d’acide chlorhydrique (Paul Mayer), jusqu’à ce que sa teinte violette passe au rouge, puis à l’alcool pur, qui reconstitue la couleur violette.

Une dissolution d’hématoxyline passe quelquefois au rouge en

GÉNÉRALITÉS SUR LA TECHNIQUE

devenant acide; il suffit, pour lui rendre sa couleur normale, de couvrir quelques instants le flacon d’un bouchon enduit d’ammoniaque.

Bleu de quinoléine. — Nous employons ce réactif de la manière indiquée par Ranvier dans son Traité technique. « On dissout la substance dans l’alcool à 36 degrés; on étend la solution d’une partie d’eau. Il faut se garder d’ajouter l’eau tout de suite, car le bleu ne s’y dissoudrait pas. Ce bleu a une grande puissance colorante, et il faut l’employer en solutions très faibles. A cet état, on peut en faire usage soit sur des tissus frais, soit sur des coupes obtenues après durcissement dans l’alcool ou l’acide picrique. Une fois la coloration produite, la préparation est lavée et montée dans la glycérine. Les préparations colorées par le bleu de quinoléine peuvent être soumises avec avantage, au moins dans quelques cas, à l’action de la potasse à 40 pour 100. L’élection de la matière colorante est alors complète et immédiate. Les noyaux sont incolores, le protoplasma cellulaire, les muscles et les nerfs sont colorés en bleu clair et la graisse en bleu foncé. »

Couleurs d’aniline. — Nous devons encore mentionner" la fameuse méthode de coloration des noyaux cellulaires de Hermann et Flenlming, qui consiste à faire usage des couleurs d’aniline et qui a fourni au dernier de ces auteurs de magnifiques résultats dans ses recherches sur la structure des noyaux cellulaires. Cette méthode n’est applicable qu’aux coupes et aux très petits objets. Les préparations sont d'abord fixées par de l'acide chromique de 0,1 à 0,5 pour 100, puis soigneusement lavées à l’eau distillée. On les place ensuite dans une solution d’aniline (safranine, mauvéine, vert solide, fuchsine, éosine, etc.), dans l’alcool absolu, pendant douze à vingt-quatre heures. On les lave à l’alcool ordinaire, puis on les transporte dans une capsule à fond blanc renfermant de l’alcool absolu, dans lequel on les agite jusqu’à ce qu'il ne s’en échappe plus de nuages colorés. Les noyaux conservent une teinte très nette. Nous renvoyons, pour les détails relatifs à chaque cas particulier, au mémoire de Walther Flemming : Ueber das E. Hermann' sche Kernfàrbungsverfahren , dans Archiv fur mikroskopische Anatomie , t. XIX, 1881, p. 317.

Teinture d’iode. — Est souvent employée pour colorer les corps gras et les muscles, elle donne de magnifiques résultats sur les arthropodes inférieurs. L’iode s’évaporant rapidement, la coloration n'est malheureusement pas stable. On l’emploiera cependant dans les recherches. La solution alcoolique simple pourra servir dans beaucoup de cas. On lui préférera cependant, en général, la solution suivante recommandée par Ranvier : Eau distillée, 100 parties; iodure de potassium, 2 parties, et iode à saturation.