PROCÉDÉ SPÉCIAL POUR LA NUMÉRATION DES LEUCOCYTES
Quand on veut numérer les globules blancs, vu leur petit nombre relatif dans le sang, on a avantage à se servir d'une dilution moins forte que pour les globules rouges. Pour ne pas être gêné par ces derniers, on les dissout par un acide faible. Au lieu d'un sérum artificiel qui conserve les globules rouges, on emploie donc pour la dilution une solution d'acide acétique dans l'eau distillée à 1-3 °/o à laquelle on ajoute une quantité de bleu de métbylène suffisante pour obtenir une légère coloration des leucocytes.
Si l'on fait la numération avec un compte (/lobules de Malassez (ou de Tlioma-Zeiss), il suffit de remplacer la pipette au 100" par une pipette au lO'' ; on aspire du sang jusqu'à 1, de l'acide acétique dilué jusqu'à 11 ; on compte les leucocytes dans un rectangle et on multiplie le cbiffre trouvé par 1,000 pour avoir leur nombre dans un millimètre cube de sang ; si on a compté dans 2. , .5 rectangles, on divise le cbiffre obtenu par 2. . .5.
Si l'on veut se servir de Xliématimètre de Hayem^ on emploie deux pipettes graduées, l'une destinée à recueillir le sang, l'autre destinée au liquide acétique qui doit avoir une contenance 7 fois supérieure à la première. On peut ainsi faire dans une petite éprouvette un mélange de sang et de liquide acétique dans la proportion de l/8^ Un calcul très simple montre qu'il suffit de multiplier par 1,000 le cbiffre des globules blancs trouvés dans le grand carré de l'hématimètre pour obtenir le nombre de globules blancs par millimètre cube de sang^
1 LiONKET et Martel. Lyon Médical, 1899, p. 431 ; et L. Marcotte. Thèse de Paris, 1902.
TECHNIQUE GÉNÉRALE
Hallion remplace la pipette capillaire ordinaire de l'hématimètre de Hayem par une pipette spéciale qui permet d'aspirer 20 millimètres cubes de sang. Ce sang est mélangé aux 500 millimètres cubes de liquide acétique aspiré dans la pipette à sérum. On compte alors les leucocytes dans .32 grands carrés, et grâce au mode de construction de l'appareil il suffit de multiplier par 100 le nombre total des leucocytes ainsi obtenus pour avoir le chiffre des leucocytes dans un millimètre cube de sang^
EXAMEN DU SANG SEC
Pour obtenir de bonnes préparations de sang sec, il faut beaucoup de précautions et une certaine habileté qui ne s'acquiert que par l'habitude.
Lames de verre. — Les lames de verre sur lesquelles on étalera le sang doivent être bien planes, neuves, non rayées ; il est nécessaire de se servir de lames rodées, les lames ordinaires employées en histologie étant mal fabriquées, et insuffisamment planes.
Ces lames seront nettoyées avec soin pour les débarrasser des corps étrangers, des poussières, et surtout de la graisse; pour cela, elles seront passées successivement à la potasse à 40 p. 100, à l'acide sulfurique dilué, à l'alcool et à l'éther, puis essuyées et séchées. Pour ne pas avoir à répéter cette opération chaque fois que l'on veut faire un examen de sang, il est bon de préparer des lames à l'avance et de les laisser dans un cristallisoir, vide ou plein d'alcool, dont le bord rodé est recouvert exactement par un couvercle rodé.
Ponction du doigt. — La ponction faite au doigt du malade avec les précautions que nous avons indiquées, on recueille la goutte de sang qui sourd du doigt, en la touchant avec une lame, sans l'écraser.
La quantité de sang obtenue doit être assez grande pour pouvoir être étalée facilement sur le tiers de la lame environ; elle ne doit pas être trop grande, car il serait alors difficile d'étaler le sang; en outre, il faut, à cause de la répartition inégale des éléments dans les différents points de la préparation, que la goutte de sang ait été toute entière étalée sur la lame en couche assez mince; la gouttelette de sang doit être moyenne.
Etalement du sang-. — L'étalement est fait au moyen d'une lame rodée : le bord de cette lame est posé sur l'autre lame et passé sur la goutte de sang de façon à l'étaler en couche mince ; il est bon d'exécuter au début de cette manœuvre quelques petits mouvements transversaux, pour que le sang s'étale sur toute la largeur de la lame. On appuiera moyennement avec le bord de la lame rodée sur l'autre lame ; si on appuie trop fort, on écrase le sang et on l'entraîne à l'extrémité
1 Cazin et Gros. Semaine médicale, 6 mai 1903, p. 141.
EXAMEN DE SANG SËC NON COLORÉ
de la lame ; si on appuie trop peu, la couche n'est pas assez mince ; d'ailleurs, suivant la richesse du sang en globules et sa consistance, la pression doit être plus ou moins forte. Pendant l'opération, la lame qui sert à l'étalement est main, tenue dans un plan oblique à celui de la lame sur laquelle a été déposée la goutte de sang; les deux plans doivent faire un angle d'environ 45".
On obtient aussi un très bon étalement en se servant, au lieu de lame rodée, d'une large lamelle ; la pression sur le sang est ainsi moins forte, ce qui facilite beaucoup l'étalement de certains sangs très peu riches en globules. On a proposé enfin de se servir du bord dune carte de visite.
Dessication. — Le sang étalé, on le dessèche rapidement par agitation à l'air; dans aucun cas la dessication ne doit être activée par le chauffage.
Toutes ces manœuvres doivent être faites avec rapidité et dextérité, pour obtenir de bonnes préparations. On peut d'ailleurs contrôler par un examen rapide sous le microscope la valeur de la préparation : dans une bonne préparation, le sang doit être étalé en couche régulière, d'épaisseur telle que les globules rouges ne se touchent pas et restent séparés les uns des autres par un intervalle égal environ à leur diamètre : s'ils sont plus rapprochés, les globules rouges se déforment par pression réciproque; s'ils sont plus espacés, le nombre des éléments cellulaires contenus dans un même champ microscopique est trop faible, la recherche et la numération des leucocytes devient plus longue.
11 est bon d'exécuter en même temps un certain nombre de préparations de sang (5 à 10) qu'on gardera à l'état sec ou qu'on colorera suivant diverses méthodes. Les préparations sèches peuvent être entassées les unes sur les autres sans danger ; il faut surtout les soustraire à la poussière et à l'humidité.
Les préparations de sang sec peuvent être examinées sans coloration, ou après coloration.
§ I". — Examen du sang- sec non coloré.
Les préparations de sang sec non coloré doivent être examinées avec un objectif à sec assez fort (ociil. I à III, object. 6 à 8. Leitz). Elles permeltent l'étude : de la forme et des dimensions des hématies, du nombre des hématoblastes, des pigments contenus dans le sang.
Sur les préparations de sang sec normal, on voit : des hématies, des leucocytes, des hématoblastes.
Les hématies de l'homme se présentent comme des disques arrondis ou ovalaires, d'une teinte jaunâtre, dont les bords sont un peu plus colorés que le centre et donnent l'impression d'être plus épais.
Les leucocytes apparaissent de distance en distance comme des
TECHNIQUE GÉNÉRALE
corps arrondis ou ovalaires, plus volumineux, plus clairs et plus réfringents, incolores ; on peut j distinguer un noyau un ^^eu plus foncé que le proLoplasma. Les leucocytes ne sont pas toujours également répartis dans tonte la préparation, on les trouve souvent amassés sur les bords de la couche sanguine.
Les hématohlasfes se montrent comme des granulations ovalaires ou irrégulières, plus petites (1 à 3 [^), isolées que les hématies ou agglomérées, incolores et possédant la même réfringence que les
Fig. 40. — Préparation de sang sec non coloré.
leucocytes. On les observe dans les points où les globules rouges sont le plus disséminés ; ils sont surtout abondants à l'endroit où a été déposée primitivement la goutte de sang.
Sur les préparations de sang sec incolore, on peut étudier les déformations des globules rouges. A un premier examen, on se rend compte facilement si le nombre des leucocytes est exagéré ou diminué, mais on ne saurait par ce procédé apprécier exactement l'état de la leucocytose. Par contre, l'étude des préparations de sang sec constitue le meilleur moyen d'apprécier la richesse du sang en hématoblastes.
Les préparations de sang sec permettent la recherche des pigments
EXAMEN DE SANG SÊC NON COLORÉ
du sang. On peut observer deux variétés de pigments, dérivés tous deux de Thémoglobine : le pigment ocre et la mélanine.
Le pigment ocre, ou hémosidérine de Quincke, se présente sous forme de granulations ou de masses irrégulières, plus ou moins volumineuses, ocreuses, situées généralement à l'intérieur des leucocytes.
Le pigment ocre est insoluble dans les acides et dans la potasse à 40 °/o. Traité par le sulfhydrate d'ammoniaque, il prend une teinte noire ; par le ferrocyanure de potassium et l'acide chlorhydrique une teinte bleue. Ces deux réactions s'obtiennent de la façon suivante :
1° Pour la première, on fait agir successivement sur une préparation de sang fixée : une solution de ferrocyanure de potassium à 2 p. 100, puis une solution d'acide cblorli)alrique à 0,05 p. 100. On monte dans la glycérine : le pigment est bleu ; 2° Pour la seconde, on fait agir une solution concentrée et froide de sulfure d'ammonium jusqu'à coloration noire, on lave dans l'eau et on monte dans la glycérine.
Ces réactions chimiques caractérisent la nature ferrugineuse du pigment ocre ; Auscher et Lapicque lui ont donné le nom de rubigine et ont montré qu'il était constitué par un hydrate ferrique.
Il est rare d'observer le pigment ocre dans le sang, la destruction des globules, dont il provient, se faisant beaucoup plus dans les organes hématopoïétiques que dans la circulation. Cependant, dans les cas où les globules sont détruits en grande quantité, comme dans le paludisme chronique, on a pu trouver du pigment ocre dans le sang.
On l'a cherché à maintes reprises dans le sang des sujets atteints de cirrhose hépatique avec diabète bronzé, pensant à la possibilité de dissémination par embolie. Auscher et Lapicque en ont une fois trouvé deux grains, mais le pigment provenait peut-être de la peau.
La mélanine se présente sous forme de granulations plus ou moins noires, arrondies ou irrégulières, dont le volume ne dépasse jamais d [jL, généralement agglomérées.
L'analyse la plus minutieuse n'y peut déceler la présence du fer Elle résiste aux acides et se dissout dans le sulfure d'ammonium.
Au cours de la fièvre palustre, ce pigment se forme dans l'intérieur des hématozoaires qui, ayant envahi les globules rouges en détrui-
TECHNIQUE GÉNÉRALE
sent et digèrent riiémoglobine ; lorsque les hématozoaires se dissocient, le pigment est mis en liberté dans le sang et englobé par les phagocytes ou par les cellules endotliéliales. Sur des préparations de
Fig. 41. — Leucocytes dans le sang d'un paludéen. — a, Leucocyte mononucléaire pigmenté; — b, Leucocyte vacuolaire pigmenté ; — c, Leucocyte ayant englobé un corps en rosace et du pigment.
sang paludéen, on le rencontre donc, soit à l'état libre, soit à l'intérieur des leucocytes^ soit dans le corps des hématozoaires. L'abon-
Fig . 42 . — Destruction des globules rouges dans le sang des paludéens (Ewing) . — a, Périodes initiales avec dépùts d'hématoïdine ; leucocytes pigmentés: — b, Périodes avancées avec cristaux d'hématoïdine.
dance des éléments pigmentés rencontrés dans le sang peut servir au diagnostic du paludisme. Ce pigment n'existe cpie dans le paludisme aigu, et disparaît assez rapidement après les accès ; dans le paludisme chronicpie, il ne se montre qu'à l'occasion de poussées aiguës.
EXAMEN DU SANG COLORÉ
Il est impossible de déterminer les relations précises existant entre la mélanine et l'hématoïdine que Ewing ^ a également retrouvée dans le corps des globules rouges chez les paludéens.
La mélanine qui se forme aussi dans certaines tumeurs mélaniques peut être mise en liberté dans le sang par suite de la destruction des cellules de la tumeur; on la rencontre dans le sang à l'état libre ou incluse dans le corps des leucocytes-. Libre, elle est disséminée dans le plasma sous forme de fines granulations noirâtres, ou rassemblée en cylindres courts et minces qui semblent être les moules de capillaires. Son existence dans le sang est Tindice de la généralisation du néoplasme ; par contre, son absence dans le sang n'implique pas qu'il n'y ait pas généralisation (Gilbert).
§ II. — Examen du saug- coloré.
Les préparations de sang colorées, qui sont d'une importance capitale en technique hématoscopique, sont utilisées surtout pour faire l'étude qualitative des globules blancs et pour établir les formules leucocytaires des états normaux et pathologiques; elles servent aussi à reconnaître les altérations qualitatives des globules rouges (dimensions, déformations, réactions colorantes anormales, etc.
Pour colorer le sang, il faut :
1° Le fixer par des réactifs appropriés, car les préparations fraîches ne supportent pas le contact de l'eau ; 2° Faire agir des solutions colorantes.
A. Fixation. — Diverses méthodes peuvent être employées pour la fixation du sang.
1° Chaleur sèche (procédé d'Ehrlich). — On peut se servir d'une platine chauffante sous laquelle on place un bec Bunsen : pour apprécier la température de la platine, on y fait de temps à autre tomber une goutte de xylol ou de toluol; quand ce liquide entre en ébuUition, la température de 110° est atteinte ; on retire alors le bec Bunsen et on dépose à sa surface les lames da sang à fixer ; on les y laisse pendant deux à cinq minutes.
1 Ewing. The Journal of experim. Medicine, février 1902.
■2 Nepveu. Bull. Soc. biologie, 1874, p. 82, et Mémoires de chirurgie, 1880, p. 163.
TECHNIQUE GÉNÉRALE
On peut encore user d'une étuve sèche ou d'un four à flamber, réglé à la température de HO°-llo''.
Mais il est préférable de se servir de la platine chauffante d'Ehrlich, constituée par une petite chaudière hémisphérique dont le couvercle est formé d'une mince lame de cuivre percée de deux trous, l'un pour l'introduction d'une centaine de grammes d'un liquide bouillant à 110-114°, le toluol pur, l'autre pour l'adaptation d'un réfrigérant qui recueille et condense les vapeurs de toluol. Ce réfrigérant est absolument nécessaire, car, avec l'appareil simple d'Ehrlich, qui en est dépourvu, on s'expose à des accidents dus à l'inflammation des vapeurs de toluol qui se répandent dans l'atmosphère.
L'appareil préparé, on allume au-dessous une lampe à alcool ; le toluol entre en ébullition et porte à la température de 110° environ le plateau de l'appareil. On pose alors sur le plateau les lames de sang qu'on veut fixer.
Pour les colorations ordinaires, un chauffage à 110° durant deux à cinq minutes est suffisant ; Ehrlich cependant conseille pour les colorations plus délicates un chauffage de deux heures ou l'emploi de températures plus élevées.
La chaleur ne doit être employée que pour les préparations fraîches ne datant pas de plus de vingt-quatre heures ; pour les préparations anciennes, les autres méthodes sont préférables.
AtxooL-ÉTHER. — Le réactif de Nikiforoff est formé par un mélange d'alcool absolu et d'éther en proportions égales.
Pour s'en servir, il suffit de faire couler quelques gouttes du mélange sur la préparation, ou mieux de tremper pendant quelques instants la préparation dans un flacon contenant ce mélange, et de laisser aussitôt sécher à l'air.
Alcool absolu (procédé de Bensaude). — L'alcool absolu, obtenu en plaçant une couche de sulfate de cuivre calciné au fond d'un flacon hermétiquement fermé qui contient de l'alcool dit absolu du commerce (alcool à 98°), est encore un bon réactif qui permet de fixer le sang après un contact de cinq minutes. Les manipulations sont les mêmes qu'avec l'alcool-éther. Le même résultat peut être obtenu en plongeant pendant une minute la préparation dans l'alcool absolu bouillant.
Acide chro.mique (Malassez). — L'acide chromique à 1 p. 100 fixe, très rapidement. La préparation est plongée pendant deux à dix secondes dans l'acide chromique, puis lavée aussitôt pendant le même temps dans de l'eau distillée.
Chloroforme (0. Josué). — La fixation est rapide. 11 suffit de verser quelques gouttes de chloroforme absolument pur, sur la lame de sang, ou de plonger celle-ci dans un flacon contenant du chloroforme, de la retirer après quelques secondes, et de la laisser sécher à l'air.
Vapeurs de sublimé-iode (Dominici et Lenoble). — Le réactif est ainsi composé : on ajoute à 3 cent, cubes de teinture d'iode fraîche, 20 cent, cubes d'une solution saturée de sublimé dans l'alcool absolu. Le mélange se décolore au bout de quelques jours, mais il peut servir encore longtemps pour la fixation,
EXAMEN DU SANG COLORÉ
La fixation est obtenue en exposant, pendant quinze secondes, la préparation de sang aux vapeurs du mtMange dont on a déposé quelques gouttes dans un godet.
Liquide de Flemming. — JoUy ' a indiqué un nouveau procédé de fixation qui consiste, après avoir étalé le sang, à le plonger immédiatement, sans provoquer la dessication, dans un réactif fixateur composé de :
Acide chromique à 1 p. 100 lo parties.
Acide osmique à 2 p. 100 4 —
Acide acétique cristallisable 1 —
La lame est laissée dix minutes dans le mélange, puis lavée à l'eau courante pendant dix minutes et séchée.
Ce procédé permettrait d'obtenir une fixation plus parfaite des noyaux cellulaires dans lesquels le réseau chromatique se dessine avec plus de netteté.
Liquide sublimé iodé (Dominici). — On mélange 10 cent, cubes de teinture d'iode fraîche avec 90 cent, cubes de la solution de sublimé saturé à chaud dans l'eau. Il se fait un précipité; on filtre. Les lames de sang sont plongées dans le liquide filtré durant 2o secondes. On lave ensuite à l'eau courante.
La solution fixatrice ne se conserve pas plus de deux à trois heures; il faut donc la préparer extemporanément.
Autres procédés. — On peut encore employer Vacide picrique^ suivant la formule de Kleinenberg :
Eau 100
Acide suif urique ■ 2
Acide picrique à saturation.
Le formol en solution alcoolique à 1 p. 100 qui fixe en 1 minule ;
Les vapeurs de formol en plaçant quelques gouttes de formol à côté des préparations sous une cloche de verre, durant 5 minutes ;
Les vapeurs d'acide osmique en solution à 2 p. 100 à la température de 37" qui fixent en quelques secondes le sang non desséché (Dominici) ;
Le liquide de Flemming fort pendant dix minutes, suivi d'un lavage à l'eau courante.
Le mélange de Nikiforoff auquel on ajoute du sublimé dans la proportion suivante :
Alcool-éther 60 ce.
Solution alcoolique saturée de sublimé 5 gouttes.
ce qui donne une fixation en l'espace de cinq minutes,
\ .JoLLY. Arch. de méd. expérimenl., janvier 1902,
TECHNIQUE GÉNÉRALE
Beaucoup de ces réactifs (chaleur sèche, vapeur d'acide osmique, acide chromique) donnent des fixations suffisantes pour servir à toutes les colorations.
Certains réactifs, au contraire, fixent avec plus de perfection, soit les granulations des leucocytes (chaleur, acide osmique, acide chromique, chloroforme, vapeurs de sublimé iodé), soit le noyau des leucocytes (alcool-éther, liquide de Flemming), soit le protoplasma des hématies (acide chromique, acide osmique, alcool-éther) et deviennent le réactif de choix lorsqu'on veut mettre en évidence l'un de ces éléments du sang.
Nous verrons plus tard, lorsque nous aurons étudié les réactifs colorants, que si pour une technique rapide on peut n'employer qu'un des fixateurs bons à tout faire de la première catégorie, il est au contraire préférable, si l'on veut avoir une technique soignée, d'user d'un jeu de fixateurs qui permettent l'action élective de certains colorants spéciaux sur les divers éléments du sang.
B. Coloration. — La coloration des éléments du sang est basée sur les affinités chromatiques distinctes que présentent les diverses parties de ces éléments.
Ces affinités sont de trois ordres :
\° Certains éléments se teintent par les couleurs dites basiques comme le bleu de méthylène, le vert de méthyle, le brun de Bismarck, le méthyl- violet, la thionine, le bien de Unna, le bleu de tohiidine. On dit qu'ils sont hasophiles : tels sont les noyaux cellulaires qui tous, avec une intensité plus ou moins grande, prennent le colorant basique ; les corps cellulaires, les granulations protoplasmiques, sont quelquefois aussi hasophiles, mais généralement à un plus faible degré ;
2° D'autres éléments se teintent au contraire par les couleurs acides, comme l'éosine, l'orange, la fuchsine acide, etc. On les dit aciclophiles ; tels sont le protoplasma des hématies et certaines granulations protoplasmiques des leucocytes.
Il ne faut pas attribuer une signification vraiment chimique à cette division des couleurs d'aniline en couleurs acides et basiques donnée
EXAMEN DU SANG COLORÉ
par Ehrlich ^ La dénomination de couleur acide n'implique nullement une réaction spécifique sur la teinture de tournesol ; on ne peut pas déduire de leur affinité colorante que les diverses parties constituantes des leucocytes aient des affinités chimiques acides ou basiques.
On assimile les couleurs d'aniline à des sels, et on donne le nom d'acides aux couleurs dans lesquelles la substance qui colore tient la place d'un acide dans la combinaison chimique ; le nom de basiques aux autres. Ainsi l'éosine sera considérée comme une couleur acide parce qu'elle est un éosinate de soude ; tandis que le bleu de méthylène qui est un chlorure de tétraméthylthionine sera classé parmi les couleurs basiques.
3" Un troisième groupe d'éléments prennent indifféremment les colorants basiques ou acides, ou bien se teintent simultanément par ces deux variétés de colorants, en prenant un ton intermédiaire lorsqu'on emploie un mélange de couleurs basiques et acides dans certaines proportions. On les dit amphophiles ou neiitrophiles. De ce nombre sont les protoplasmas de beaucoup de corps cellulaires et les granulations de certains leucocytes.
Ces principes établis, nous indiquerons les principales colorations utilisables.
1» Coloration par l'hématéine-éosine. — La préparation est soumise d aljord à l'action de l'hématéine préparée suivant la formule de Mayer :
Hématéine 1 gr.
Alcool 100 ce.
Verser la solution colorée dans la solution suivante chaude :
Alun 50 gr.
Eau distillée bouillante 1000 gr.
Ajouter un cristal de thymol. Filtrer après refroidissement et conserver dans l'obscurité.
On laisse agir l'hématéine plus ou moins longtemps, suivant son activité, qui est déterminée par l'expérience, puis on lave rapidement à l'eau ; les noyaux seuls doivent se colorer, les hématies doivent rester incolores,
' Erlicii. Ueber die specifischen Granulationcn des ^IvXes.Verliandliing dev physiol. Gesells. zu Berlin, 1878-79, n» 20; et Farben anahjtische Untevsuchungen zur Hislol. und Klinik des Blutes. Berlin, 1891.
TECHNIQUE GÉNÉRALE
On colore ensuite lentement avec une solution aqueuse d'éosine à l'eau à 0,S p. 100, jusqu'à ce que les hématies aient pris une teinte franchement rose. On lave à l'eau, et on laisse sécher la préparation.
J. Courmont et Montagard recommandent de colorer d'abord par l'éosine, de laisser sécher et de colorer ensuite par l'hématéine.
On obtient ainsi de très belles préparations clans lesquelles les noyaux leucocytaires et les hématies se dessinent avec une netteté parfaite ; le protoplasma des leucocytes mononucléaires et celui des leucocytes polynucléaires a pris une teinte lilas clair, les granulations éosinophiles sont très nettes et ont pris une belle teinte rose. Mais dans ces préparations, très utiles pour étudier les noyaux et les granulations éosinophiles, les granulations ueutrophiles et basopliiles passent inaperçues.
Dans cette méthode, on peut remplacer l'hématéine de Mayer par l'hématoxiline de Bœhmer, de Delafield, de Renaut, etc.; l'éosine peut être remplacée par l'aurantia. On peut encore employer le mélange suivant indiqué par Ehrlich :
Eosine (cristall.) 0 gr. !i
flématoxyline 2 gr.
Alcool absolu |
Eau distillée / àà 100 gr.
Glycérine '
Acide acétique glacial 10 gr.
Alun en excès.
Laisser reposer la solution pendant quelques semaines, le mélange colore en une 1/2 heure à 2 heures.
2° Coloration par l'éosine — bleu de méthylène (Ghenzinsky). — La préparation est placée pendant 6 à 24 heures à l'étuve, dans un vase hermétiquement
fermé, contenant la solution suivante :
Solution aqueuse concentrée de bleu de méthylène 40 ce.
Solution d'éosine à 0,5 p. 100 dans l'alcool à 70" 20 ce.
Eau distillée 40 ce.
Méthode de Bensaude. — On peut obtenir la même coloration plus rapidement par la méthode suivante :
Colorer pendant 3 minutes à chaud dans la solution :
Eosine 0 gr. bO
Alcool à 70» 100 gr.
Laver à l'eau. Colorer pendant 3 minutes à froid dans une solution aqueuse concentrée de bleu de méthylène. Laver à l'eau. Laisser sécher à l'air.
ËXAMEN DU SANG COLORÉ
Par cette méthode, les noyaux et les granulations basophiles se colorent en bleu, les hématies en rose, les granulations acidophiles en rouge vif. Méthode de Ziemann. — On prépare une solution de :
Bleu de méthylène raéd. pur (Hôchst) 1 gr. o
Borax 2 gr. 5
Eau distillée 100 gr.
et une solution de :
Eosine (marque B A ou A G, Hôchst) 0 gr. 1
Eau distillée 100 gr.
Les deux solutions sont mélangées dans une éprouvette graduée dans la proportion de 1 à 4, et versées sur les lames de sang placées au fond d'une boite de Pétri. Après o minutes, la pellicule irisée qui s'est formée à la surface du liquide est enlevée, et la préparation apparaît d'un bleu violet intense. Elle est alors plongée dans une solution très étendue d'acide acétique, d'où elle ressort rouge, puis lavée à l'eau, séchée et montée dans le baume.
3° Coloration par le triacide d'ehrlich. — La solution triacide d'Ehrlich est fabriquée de la manière suivante :
On commence par préparer des solutions aqueuses saturées d'orange, de fuchsine acide et de vert de méthyle, qu'on laisse reposer durant plusieurs jours jusqu'à clarification complète.
On mélange ensuite :
Solution d'orange 13-14 oc.
Solution de fuchsine acide 6-7 ce.
Eau distillée , la ce.
Alcool lo ce.
Vert de méthyl 12,5 ce.
Alcool 10 ce.
Glycérine 10 ce.
Les solutions, mesurées avec la même éprouvette, sont ajoutées dans l'ordre indiqué ci-dessus. A partir de l'addition du vert de méthyle, le mélange sera fortement agité. La solution peut être employée immédiatement et se conserve assez longtemps.
Il est difficile de fabriquer soi-même la solution de triacide d'Ehrlich ; il est préférable d'utiliser les solutions commerciales telles que celles de Grïibler. Il est inutile d'avoir une grande provision de triacide, la solution s'altérant assez rapidement. Elle doit être versée directement sur la préparation sans filtration.
Morel et Doléris ont indiqué un procédé de perfectionnement à apporter à la préparation du triacide. Aux solutions colorantes mélangées dans les proportions indiquées par Ehrlich, on ajoute un volume égal d'une solution à 8 p. 100 de formol dans l'eau distillée et de 1 p. 100 d'acide acétique. Le formol fixe le vert de méthyle.
TECHNIQUE GÉNÉRALE
Les préparations fixées par la chaleur se colorent en 15 à 20 minutes clans le triacide. On lave soigneusement à l'eau et on sèche ; on peut aussi laver à l'alcool absolu, les granulations apparaissent plus nettes, mais les noyaux sont plus pâles.
Par le procédé d'Ehrlich, les noyaux sont bleu verdàlre, les hématies sont brunâtres ou cuivrées, les granulations acidophiles et les granulations neutropliiles rouge violet, les granulations des mastzellen restent claires et incolores.
4° Bleu de toluidine — éosine — orange (Dominici). — Les lames de sang, fixées par leprocédé de Dominici, sont colorées de la façon suivante : on les soumet d'abord durant deux minutes à l'action d'une solution faite par le mélange on parties égales de solutions d'éosine (Grûbler) et d'orange (Grùbler) dans l'eau distillée à 1 p. 100. On lave à l'eau courante.
On colore ensuite durant deux minutes par une solution dans l'eau distillée de bleu de toluidine (Grùbler) à 1 p. 200. On lave à l'eau courante.
On décolore ensuite très rapidement avec l'alcool à 60° ; puis on déshydrate à l'alcool absolu. Le passage dans l'alcool absolu doit être très rapide si l'on ne veut pas obtenir une décoloration complète.
Les granulations basophiles sont colorées en bleu ; les neutrophiles en violet rouge ; les acidophiles en rouge orangé ou en rose.
Pour avoir une bonne préparation il faut suivre avec une précision absolue la technique indiquée ; avoir un alcool titrant exactement 60°, etc.
5° Coloration par la thionlne. — La solution de thionine phéniquée est préparée de la façon suivante (Nicolle) :
Thionine 0 gr. bO
Alcool absolu 10 gr.
Ajouter peu à peu après dissolution :
Eau phéniquée à 1 p. 100 100 gr.
On fait agir la thionine une à deux minutes sur les préparations, puis on lave à l'eau et on sèche.
Les noyaux sont colorés en bleu violet, les hématies en vert, les granulations des mastzellen se détachent en violet rouge.
Certains auteurs préfèrent une solution hydroalcoolique de thionine qui colorerait mieux les granulations des mastzellen :
Thionine 0,3 gr.
Alcool absolu 10
Eau phéniquée à 1 p. 100 100 —
6° Bleu de méthylène polychrome. —
Le bleu polychrome de Unna, étendu
