PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE

chauffe de nouveau, alcalinise à 80° : il S£ tonne dos flocons qui clarifient le liquide: on filtre, puis on chauffe à l'20°, on filtre une dernière l'ois el on répartit dans les Moles, qui sonl ensuite stérilisées à 1 15u.

Préparation du sérum sanguin. — Dans un flacon stérile, à large ouverture, couvert à Paidc d'un cristallisoir semboitant sur le col, on recueille le sang le plus près possible de la saignée, en évitant l'introduction des poussières.

On abandonne ce sang dans un endroil frais pendant vingt-quatre heures. Quand le caillot esl bien rétracté, on aspire dans des pipettes stériles, régulièrement el sans à-coup, le sérum que Pou répartit ensuite dans des Qoles bouchées d'ouate ou dans des tubes à essais stériles. On stérilise les tubes de sérum par chauffages discontinus à + 58° dans un bain-mari e, une heure chaque jour pendant six à sept jours. On a ainsi le sérum liquide stérile.

Le sérum solide s'obtient en chauffant à la température de 08° à 70° pendant quarante à cinquante minutes; généralement on solidifie le sérum dans des tubes inclinés. 11 suffît pour cela de disposer les tubes sous une inclinaison convenable, dans une petite étuve de d'Arsonval réglée ;i 6S6 ; ils doivent être retirés immédiatement après la solidification totale.

Sérums agg-lutinatifs. — Les préparations de sérums agglutinatifs : fièvre typhoïde, colibacille, choléra, etc., en raison des frais qu'elles occasionnent, des aménagements et soins spéciaux que nécessitent les grands animaux qui fournissent les sérums, ne peuvent être généralement faites dans les laboratoires d'analyses. On doit donc recourir, pour s'en procurer, aux services des Instituts Pasteur ou autres laboratoires spéciaux.

Pommes de terre. — Les pommes de terre, assez grosses et saines, sont net lovées à l'aide d'une brosse et plongées dans une solution de sublimé au millième pendant une heure. On coupe les deux extrémités de la pomme de terre, on place l'une des extrémités sur plusieurs épaisseurs de papier filtre, et on enfonce dans Paxc de la pomme l'emporte-pièce de Queyrat; on a ainsi deux demi-cylindres de pomme de terre qu'on lave à Peau stérile; on sèche dans du papier à filtre et on les introduit dans <\c^ tubes de Roux. On stérilise à l'autoclave pendant trente minutes à 115?, de manière à assurer la destruction des germes sporulés très nombreux (B. mesentericus) sans toutefois altérer les pommes de terre.

Coloration des bactéries. — Les matières colorantes les plus usitées sont : les rouges de fuchsine el de rubine; les violets de gentiane : violet de méthyle ; krystall-violel ; thionine : le vert de méthyle, le bleu de méthylène; l'éosine. On en fait des solutions alcooliques saturées dans Palcool à 90°, ou des solutions aqueuses saturées que l'on conserve à l'abri de la lumière.

Traité d'hygienk. II. — 10

242 J. OGIER ET ED. BONJUAN. — L'EAU. BACTERIOLOGIE.

Pour les colorations instantanées des germes prélevés sur différents milieux, on utilise ces solutions plus ou moins étendues d'eau.

( )n emploie aussi diverses solutions complexes dont nous donnons ci-dessous quelques formules :

Fuchsine phéniquée de Ziehl. — On dissout en agitant :

Fuchsine 1 gramme.

Acide phénique 5 grammes.

Alcool 10 —

Au bout de vingt-quatre heures on ajoute 90 centimètres cubes d'eau. Violet aniline d'Ehrlich.

Solution alcoolique saturée de violet de gentiane.. 2 cent. cub.

Alcool absolu 1 —

Eau saturée d'huile d'aniline 9 —

Pour les colorations plus faibles, 4 centimètre cube de solution de violet suffît.

Violet plié nique de Nicolle.

Solution alcoolique saturée de violet de gentiane.. 10 cent. cub. Eau phéniquée à 1 p. 100 100

Thionine phéniquée de Mcolle.

Thionine 1 gramme.

Acide phénique cristallisé 2 grammes.

Alcool 10 —

Bleu de Lof fier.

Solution de potasse caustique à 100 cent. cub.

Solution alcoolique saturée de bleu de méthylène. 30 —

Éosine. — Solution aqueuse et solution hydro-alcoolique (faible en alcool).

Nous ajouterons comme réactifs complémentaires Y essence de girofle pour l'éclaircissement des préparations, le xijlol pour le dégraissage, Yalcool absolu, le mélange alcool-éther à volumes égaux, pour la décoloration et le séchage rapide ; enfin le baume obtenu en dissolvant à consistance sirupeuse le baume de Canada sec dans du xylol pur et en décantant la solution limpide ainsi obtenue.

Nous rappellerons que les lames et lamelles doivent être conservées dans l'alcool et essuyées à laide d'un linge de mousseline avant leur emploi, ou mieux nettoyées d'avance et conservées à l'abri des poussières.

Pour les laines et lamelles ayant servi, nous conseillons de les jeter dans une conserve couverte renfermant une solution sulfurique

PRÉPARATION DES MILIEUX DE CULTURE. fc 243

étendue de bichromate de potasse, qui a le double avantage de stériliser et de nettoyer ces objets très complètement.

Examen morphologique des germes. - On examinera les germes cultivés sur les différents milieux, avec et sans colorants, et Ton déterminera si le germe « prend » ou « ne prend pas le Gram ».

Sans colorants.— Pour les milieux liquides, on prélève à l'aide d'une pipette très fine une gouttelette que Ton dépose sur la lame, on recouvre de la lamelle et on examine sans condensateur Abbe,' en diaphragmant et avec l'éclairage oblique.

Pour les milieux solides, il suffit de prélever une partie extrêmement faible de la colonie à laide du fil de platine et de la délayer aussi régulièrement que possible dans une gouttelette d'eau déposée sur la lame.

On constate notamment le degré de mobilité des germes (bien entendu, il importe de savoir distinguer les mouvements vrais des mouvements indépendants, brownien et autres); on observe aussi la présence des spores.

Avec colorants. -Les cultures sur milieux solides ou liquides peuvent être examinées en préparations extemporanées par délayage dans une fine gouttelette de solution colorante : celle que nous employons de préférence est la solution aqueuse de rubine.

On doit compléter cet examen rapide en fixant les germes et en les colorant d une façon durable. A cet effet, on étale une parcelle fine du milieu solide sur la lame, ou on délaye dans une gouttelette d eau distillée une parcelle de culture prélevée sur le milieu solide et on étale l'émulsion sur la lame. On fait sécher à l'étuve ou près la flamme, sans dépasser 60°; la lame étant, sur un espace central de 2 centimètres carrés environ, recouverte d'un enduit aussi homogène que possible, on dégraisse en faisant couler à la surface quelques gouttes de xylol; on fait sécher, puis on colore, par exemple avec la solution hydro-alcoolique de rubine; le colorant de Ziehl ouïe violet aniline d'Ehrlich donnent d'excellentes colorations à la condition de les diluer sur la culture même. La préparation étant bien colorée, on la lave à grande eau. On peut l'examiner au microscope à ce moment; sinon, on la sèche au papier mousseline et mieux a l'étuve ; lorsqu'elle est complètement sèche, on y met une goutte d'huile à immersion et on examine au microscope. Rappelons qu'il est toujours possible de nettoyer la préparation, en enlevant 1 huile au moyen de lavages au xylol.

Coloration des cils. - On prélève une fraction de jeune culture sur strie de gélose ou de gélatine, sans entraîner aucune parcelle du milieu de culture; on délaye dans 1 centimètre cube d'eau distillée stérile et on répartit à l'aide d'une pipette très effilée de fines gouttelettes de l'émulsion sur des lames neuves lavées à l'alcool rigoureusement propres, non altérées et bien sèches.

2*4 .). OGIËR ET EU. BONJËÀN. — L'EAU. BACTERIOLOGIE.

On fail sécher à l'éjuve. I.;» coloration esl e&ectuée de préféreuce

par le procédé de Van Ermengem. On fi\e h» préparation à froid (une heure , ou à chaud (quinze minutes à l'aide de la solution suivante, en évitant la dessiccation :

Solution aqueuse d'acide osmique à 2 p. 100 1 gramme.

Solution de tanin à 25 p. 100 2 grammes.

On lave ensuite à l'eau distillée. Puis on sensibilise pendant deux à trois minutes au moyen d'une solution de nitrate d'argent à 1 p. 100 ; les enduits prennent une teinte grisâtre. Après avoir fait écouler le nitrate d'argent, sans laver, on réduit en faisant agir pendant une ou deux minutes la solution suivante :

Acide gallique 5 grammes.

Tanin H —

Acétate de soude l'on lu 10 —

Eau 350 —

On lave à fond à Teau distillée, on laisse sécher et on examine au microscope.

Méthode de Gram. — Le liquide de Gram se compose de :

Iode 1 gramme.

Iodure de potassium 2 grammes.

Eau distillée 200 —

Après avoir fixé et dégraissé la culture comme nous l'avons indiqué, on verse sur l'enduit, en tenant la lame légèrement inclinée, la solution de violet aniline d'Ehrlich ou le violet phéniqué de NicçJle ; après deux ou trois minutes on laisse tomber l'excès de solution colorante et on fait couler sur la préparation un peu de liquide de Gram : il se forme une pellicule mordorée; on laisse le liquide agir deux ou trois minutes et on décolore en faisant couler à la partie supérieure de l'alcool absolu comme si on voulait laver la préparation ; lorsque la matière colorante en excès a complètement disparu (environ quinze secondes), on lave au xylol goutte à goutte ; on sèche et on examine.

Nous ne pouvons, dans le cadre de cet ouvrage, entrer dans des détails techniques qui, en dehors des données précédentes strictement applicables aux analyses des eaux, seraient plutôt du domaine d'un traité tic technique microbiologique. Pour la préparation d'autres milieux de culture, ou pour de plus amples détails relal ifs aux appareils, autoclaves, «'luxes, microscopes, appareils à tiltration, préparations, stérilisation, outillage bactériologique, technique des ensemencements, des inoculations, des examens des cultures, etc., on consultera avec intérêt L'excellent Précis de microbie de L.-Il,