ENSEMENCEMENT DES ÉCHANTILLONS

Thoinot et E.-J. Masselin, dont la partie technique a été entièrement remaniée par Binot, chef de laboratoire à l'Institut Pasteur (1), ou le Traité de baelérioloyie si bien documenté de Macé (2) et celui de Miquel él Cambiëi* (3).

ENSEMENCEMENT DES ÉCHANTILLONS D'EAU. - Pour mettre une eau eu culture', nous employons :

Trois pipettes â numération enfermées dans des étuis de verre : ces pipettes portent une étiquette indiquant le nombre de gouttes qu'il esl nécessaire de l'aire tomber pour avoir 1 centimètre cube d'eau:

Neuf cristallisoirs ou boîtes à culture;

Neuf tubes renfermant 10 centimètres cubes de gélatine nutritive:

Une fiole Pasteur de 250 centimètres cubes renfermant 100 centimètres cubes de bouillon et jaugée à 200 centimètres cubes au moyen d'un trait tracé avec de l'acide fluorhydrique:

Deux petites fioles Pasteur renferment 10 centimètres cubes de bouillon.

On commence par faire fondre les tubes de gélatine et on en verse le contenu, avec toutes les précautions que commande la technique bactériologique, dans les cristallisoirs ou boîtes de culture étiquetées d'avance et tiédies par un séjour de quelques minutes à fétuve à 36°, afin d'éviter la condensation abondante qui se produirait sous le couvercle si ce dernier était froid.

On prend un tube scellé renfermant l'eau à examiner et qui a été conservé dans la glace.* On l'agile assez vivement et à plusieurs reprises pour obtenir une égale répartition des germes et pour s'assurer que la fermeture était bien hermétique. Puis, un peu audessus du niveau du liquide, on fait avec une lime fine ou un couteau a verre un trait, et l'on achève de briser le tube en présentant le trait à la pointe d'une petite flamme.

On plonge alors la pipette stérilisée dans le tube, on aspire l'eau et on ensemence successivement trois boîtes de culture en entrebaillant le couvercle et en laissant couler de la pipette, tenue assez obliquement, un nombre de gouttes correspondant à un centimètre Cube, un demi-centimètre cube et un quart de centimètre cube. Ces trois boites sont remuées doucement et assez longtemps, de façon à bien mélanger la gélatine et l'eau ensemencée, et à répartir également les germes ; puis elles sont placées sur la table refroidissante où on laisse la gélatine se solidifier.

Avec un autre tube, et en se servant de la même pipette que précédemment, on introduit 1 centimètre cube d'eau dans l'une des fioles Pasteurà 10 centimètres de bouillon, ce qui revient à faire une dilution del'eauau dixième. Avec le troisième tube et toujours avec la même

(1) L.-II. Thoinot et J. Masselin, Précis de microbie, ic édition, 1902.

(2) Mace, Traité de bactériologie, 4e édition, 190 i.

(3) Miquel et Cambier, Traité de bactériologie, 190-i,

pipette, on introduit! centimètre cube d'eau dans la grande fiole Pasteur renfermant 100 centimètres cubes de bouillon, ce qui fait une dilution au centième. On se sert des deux fioles qui viennent d'être ensemencées pour deux séries de trois boites de culture : à cet effet on emploie deux autres pipettes, Tune pour la dilution au dixième, l'autre pour la dilution au centième, et dans chaque cas on ensemence I centimètre cube, un demi-centimètre cube et un quart de centimètre cube. Dans la fiole de bouillon ordinaire, qui jusqu'ici n'a pas reçu d'eau, on verse environ 10 centimètres cubes de l'eau qui reste dans chacun des tubes; elle est ensuite mise dans l'étuve à 37°.

La grande fiole quia servi à faire la dilution au centième est ensemencée massivement avec 100 centimètres cubes d'eau (1) provenant de l'un des flacons conservés dans la glace : puis cette grande fiole et celle qui a servi à faire la dilution au dixième sontphéniquées à 1 p. 1000 au moyen d'une solution d'acide phonique à 5 p. 100 renfermée dans une burette de Dupré; ces deux fioles sont ensuite mises à l'étuve à 42°.

Les cultures sur gélatine sont abandonnées à la température atmosphérique dans un endroit peu éclairé.

Numération. — Cette opération très simple consiste à compter le nombre de colonies visibles sur ou dans la gélatine des boîtes de cultures, au bout d'un temps qui peut varier de huit à vingt-cinq jours.

Pour chaque boîte, la numération est pratiquée lorsqu'on juge le moment propice, c'est-à-dire le plus tard possible, mais avant que la gélatine ait subi une liquéfaction excessive ou soit envahie par l'extension trop rapide de certaines colonies. — On note pour chaque boîte le nombre de jours écoulés depuis l'ensemencement, le calibrage de la pipette, le nombre de gouttes d'eau employées. — Le compte des colonies se fait aisément à l'aide du numérateur à secteur, dont il a été question plus haut, qu'on place sur une feuille de papier noir et sur lequel on pose la boite à examiner. Les colonies se détachent alors très nettement sur le fond noir du secteur, tandis qu'elles sont à peine visibles dans les autres parties de la plaque. L'opérateur, une plume à la main, marque sur les parois du cristallisoir les limites du premier secteur et compte toutes les colonies visibles sur le champ noir. Puis, il fait tourner le cristallisoir et amène sous ses yeux un nouveau secteur faisant suite au premier qu'il limite également par un trait de plume et dont il fait le dénombrement : ainsi de suite jusqu'à ce qu'il soit arrivé à son point de départ, toute la surface de la plaque ayant ainsi défilé devant ses yeux.

Par le calcul on ramène le nombre de colonies au centimètre cube. On prend finalement la moyenne des numérations.

(1) On détermine cette quantité soit par un trait de jauge sur la fiole, soit par pesée directe sur une petite balance.