POUVOIR

REDUCTEUR

avant inversion

après inversion

Saccharose. . .

Raffinose

Dextrose

Lévulose

Lactose

Galactose

Maltose

Dextrine

13. Calculs du dosage. — Lorsqu'il y a pas mélange de sucres, on découvre assez facilement qu'elle est la qualité et la quantité du sucre présent par une polarisation et par une réduction, dont les données doivent alors coïncider. La vérification se fait vite en évaluant le poids au moyen du pouvoir réducteur, et en cherchant si la rotation

calculée au moyen de ce poids coïncide bien avec l'expérience. Une seule opération suffirait si on avait à l'avance le poids du sucre dissous ou si on connaissait sa nature. Mais quand ces éléments manquent, il faut deux déterminations expérimentales pour qualifier un sucre et pour le peser. Quand il y a plusieurs sucres, le cas est plus embarrassant, et il faut un peu de dextérité ; généralement, on sait à l'avance quels sont quelques-uns au moins des sucres présents, et on peut, connaissant leurs pouvoirs rotatoires et réducteurs, faire la part des autres, et les isoler en quelque sorte par le calcul en leur attribuant les résidus laissés par la distraction des pouvoirs réducteurs et rotatoires des sucres sur lesquels on est renseigné. On peut faire en général deux mesures de rotation avant et après inversion, deux mesures de réduction avant et après inversion, et avoir ainsi quatre équations dont on peut tirer soit deux identifications et deux quantités, soit quatre quantités si les identifications sont faites d'avance. Quand il y a du maltose dans le mélange, on peut en superposant une inversion Lindet à une inversion Clerget, obtenir une 5" équation. Mais il est clair que tout cela constitue un peu une pêche en eau trouble. Je me bornerai à donner comme exemple le cas où on a un mélange d'amidon non altéré, de dextrine et de maltose.

On commence par déféquer la liqueur et la filtrer, ce qui retient l'amidon. Il ne passe qu'un mélange de dextrine et de maltose qu'on peut doser par deux procédés :

1" Sur une portion de la liqueur on dose par réduction le maltose existant. On chaufïe ensuite une autre portion à 120" pendant vingt minutes avec 2 0/0 d'acide sulfurique et on dose le glucose formé. Du poids total de glucose on retranche celui qui résulte de l'interversion du maltose, et qu'on obtient en multipliant le poids de maltose trouvé par le facteur l,0o26. Le glucose restant correspond à la dextrine saccharifiée. En le multipliant par 0.9, on a le poids de dextrine contenue dans la solution ;

2" On prend la déviation de la liqueur en notant avec soin la température. On dose le maltose par réduction. On en conclut la déviation correspondant au maltose. On la retranche de la déviation totale, le reste est la rotation due à la dextrine, et il est facile d'en conclure le poids de cette substance.

Revenant ensuite à la liqueur primitive, on en sacchariiie l'amidon. M. Grimbert s'est assuré qu'avec 2 0/0 d'acide sulfurique ou clilorhydrique, on peut saccharifier l'amidon en 20 minutes, en opérant dans l'autoclave à 120". On fait un nouvel essai saccharimétrique de la liqueur ainsi traitée. On retranche tout le sucre provenant du maltose et de la dextrine. Tout le reste du sucre, multiplié par le facteur 0.9 représente l'amidon de la liqueur.

14. Dosage des divers alcools de la série grasse. — J'ai dit, dans le tome I de cet ouvrage (p. 152), ce que c'est que la tension superficielle, comment on la mesure par le poids des gouttes formées à l'extrémité d'un tube de dimensions déterminées, ou par le nombre de gouttes fournies par un volume donné- de liquide. Dans le tome II (p. 6), j'ai décrit un compte-gouttes très simple et je l'ai fait servir au dosage de l'alcool ordinaire. C'est ce même compte-gouttes qu'on peut faire servir au dosage des autres alcools.

Ces compte-gouttes existent dans le commerce ; mais l'expérience m'a appris que les constructeurs trouvent quelques difficultés à les fabriquer. C'est qu'ils ne se rendent pas compte du mécanisme de la formation des gouttes. En se renflant k l'extrémité inférieure de l'appareil, la goutte s'entoure, par le jeu des forces capillaires, d'une membrane élastique et résistante, à la façon d'une pellicule de caoutchouc qui se tend et se brise lorsque sa tension atteint un certain niveau, dépendant de la composition du liquide. Quand cette valeur est atteinte par suite de l'augmentation graduelle du poids de la goutte qui goiitle le sac

la paroi cède le long- du cercle de gorge de la goutte, cercle qui présente à très peu près le même diamètre que l'oritice au-dessous duquel la goutte se forme. Cette goutte tombe, et une autre se forme, grossit et tombe à son tour quand elle a le même poids et par conséquent la même grosseur que la première. Le poids des gouttes dépend donc uniquement du diamètre de la surface d'attache de la goutte à l'appareil, et ce diamètre à son tour est déterminé pratiquement par la condition que, lorsqu'on opère à 15°, avec l'eau distillée, chaque goutte pèse exactement 50 milligrammes, ce qui donne 100 gouttes pour les 5 ce. d'eau contenus dans la pipette. Le diamètre du cercle sur lequel se forment les gouttes est approximativement de 3"^ralo.

Ces gouttes à leur tour ne doivent pas se suivre trop vite : il faut que le liquide qui les forme y arrive sans vitesse ; il convient de ne pas trop s'éloigner d'une seconde comme périodicité. Ceci dépend à son tour du diamètre et de la longueur du canal capillaire dont est percé l'orifice d'écoulement. C'est le frottement sur la paroi du canal qui sert de frein, et ce frottement est d'autant plus retardateur que le canal est plus long pour un même diamètre, ou plus étroit pour une même longueur. Il est facile de disposer de l'une ou de l'autre de ces dimensions pour obtenir le résultat voulu.

Ce bec doit en outre être entretenu bien propre et n'être jamais touché avec les doigts. La plus petite trace de matière grasse à sa surface s'étend en voile invisible à la surface des gouttes d'eau qu'il porte, et en diminue la tension superficielle, de sorte que le poids de la goutte est réduit et le dosage faussé. Une fois la pipette remplie par aspiration, on amène l'affleurement au trait, et on nettoie le pourtour de l'orifice d'écoulement avec un fiagment de papier buvard. C'est précisément cette facilité de nettoyage de la surface sur laquelle se forment les gouttes qui m'a fait préférer la méthode du compte- gouttes, proposée par

MM. Le Bcrqiiier et Limousin, {i la méthode des tubes capillaires, où c'est aussi la tension superficielle qui règle les hauteurs d'ascension des divers liquides, mais dont le nettoyage intérieur est aussi difficile que nécessaire.

Pendant l'écoulement, on installe la pipette au moyen d'un bouchon sur un flacon à large g'oulot^ en la mettant bien verticale. Puis on compte. La numération n'est pas aussi ennuyeuse qu'on pourrait le croire : elle devient bientôt tout à fait instinctive, et n'en est que plus sûre. Voyons maintenant comment, du nombre de g-outtes fourni, on va tirer la nature et la quantité d'alcool dans les 5 ce. de liquide.

15. Principe de la métliode. — La méthode exige d'abord que la dissolution étudiée ne contienne que de l'alcool. C'est à quoi il est facile d'arriver par distillation dans un liquide neutre, ou même alcalin, de façon à retenir les aldéhydes qui se forment fréquemment dans les procès de fermentation, et dont la présence, comme nous le verrons plus bas, viendrait fausser le dosage. Nous supposerons donc que nous avons atfaire à une simple dissolution alcoolique. Nous supposerons en outre, pour commencer, qu'il n'y ait qu'un seul alcool présent. Il s'agit de savoir lequel.

Les solutions de divers alcools se ressemblent beaucoup en ce qui concerne leurs qualités physiques. Elles ont à peu près même densité, même point d'ébullition, même indice de réfraction, etc., quand elles contiennent la même proportion de divers alcools. Elles ont au contraire des tensions superficielles fort inégales, et donnent des nombres de gouttes très différents, qu'il est facile de déterminer à l'avance, en s'adressant à des alcools bien déterminés et purs. Une fois ce travail fait, et les tables qu'on trouvera plus ]jas dressées, le problème devient facile : chacun de ces alcools est caractérisé par sa densité et son nombre de gouttes. Le nombre de gouttes correspondant h une

certaine densité donne le iwm de Talcool ; la densité mesurée soit à l'alcoomètre, soit de préférence par la méthode du flacon, donne la proportion centésimale en volumes. De sorte qu'une solution alcoolique inconnue étant donnée, on la passe au compte-gouttes, on cherche dans les tables celle où le nombre de gouttes trouvé correspond à la densité, et cette table donne, par une seule lecture, le nom de l'alcool et sa proportion dans le mélange.

16. Tables. — Cela posé^ voici les tables correspondant aux divers alcools. Pour les premiers de la série, les plus solubles dans l'eau, je n'ai pas poussé plus haut que la proportion de 10 0/0 en volumes, parce que, au delà, le compte-gouttes perd de sa sensibilité, tandis qu'il est supérieur à toute autre méthode pour l'étude des solutions très étendues. On peut d'ailleurs ramener dans les limites des tables, par dilution, les liquides alcooliques plus concentrés. Pour les alcools peu solubles dans l'eau, et qui, dans les distillations de liqueurs fermentées, viennent former des gouttelettes ou des couches continues à la surface du liquide distillé, j'ai poussé jusqu'à la limite de saturation. Seulement, comme ils sont moins abondants que les autres, et qu'ils font varier beaucoup plus le nombre de gouttes, j'ai davantage détaillé la table pour eux, de façon à permettre un dosage au millième.

Les densités marquées sur le tableau sont exprimées en millièmes. Dans ces limites, elles peuvent être considérées comme identiques pour les divers alcools ramenés au même titre.

ALCOOLS MlVniYLign:, ÉTHYLiy[K I:T I'ROI'YLIQUE

Alc.iol 0/0

Don si tés

NiiMliRE

DE (IDUTÏES

en vdhmu's

Air. nirlliyl.

Al(

■. élliyl.

Alo. |Fi'0|iyl

ALCOOLS BUTYLIQUE ET AMYLIQUE

Alcool 0/0

Densités

l.ÔOO

NOMIiRE DE

r.OI'TTES

en volumes

A. I)uty

lique

A. aniylique

La figure 1 rassemble, dans un tableau synopti(|ue, tous ces résultats, et donne en même temps un moyen, encore

MKÏHODES DE DOSAGE

A IcogI p^ WO en volumes .

to

Fig. 1

CIIAPITUE II

plus rapide que [remploi des labiés, pour trouver la nature et la proportion d'un alcool. Elle porte, en effet, à sa partie supérieure, une échelle des densités, mesurées par la méthode du flacon, à 15". Une fois connue celle du

Alcool p.' lOÛ en volumes

Fig. 2

liquide sur lequel on opère, et qu'on peut déterminer, si on veut, dans une première approximation, et si on a assez de liquide, par une pesée soigneuse à l'alcoomètre, on n'a qu'à chercher, dans la coloixne verticale marquée par la densité, quel est l'alcool qui fournit le même nombre de

gouttes, et le problème est résolu. Si par exemple un liquide qui pèse 2° à l'alcoomètre, ou qui a une densité de 997, donne 157 gouttes à la pipette, il contient 2 0/0 d'alcool butylique. Gomme Tindication de l'alcoomètre est toujours un peu difïérente, avec les alcools de degré supérieur, de la densité réelle, il faudra, si on veut de la précision^ corroborer cette première indication par une mesure exacte de la densité. Mais les différences de nombres de gouttes entre des alcools au même degré sont telles (jne cela est souvent inutile.

(]omme, avec l'alcool butylique et amyliquc, le nombre des gouttes varie très rapidement avec la ricbesse alcoolique, on a consacré à ces 2 alcools, fréquemment présents dans les liquides de fermentation, une figure spéciale à plus grande échelle pour les solutions étendues, et qui s'explique d'elle-même. La ligne supérieure des densités s'y réduit à droite (Fig. 2).

IT. Corrections de température. — Toutes les déterminations qui précèdent sont censées faites à la température de lo". Mais on peut ne pas s'astreindre à cette obligation. Il est facile, en se servant de tables iiien connues, de passer de la densité déterminée à une température quelconcjue à ce que nous avons appelé la f/ensiir à 15", c'està-dire au rapport entre les poids de volumes égaux de liquide alcoolique et d'eau distillée à cette température. Pour le nombre de gouttes aussi, il existe une table de corrections que l'on peut simplifier de la manière suivante :

;{:> \ c:iiAPrniK ii

Lorsqu'un alcool donne à 15" le nombre de gouttes indiqué dans la colonne correspondante du tableau, les nom- Jjres qu'il donne aux autres températures sont, pour des différences de 5", représentées appro.ximativement par les chiliVes ci-dessus. Les corrections qui sont très petites, à moins qu'on ne fasse l'expérience à une température très ditl'érente de 15", peuvent être faites de tète, de sorte qu'il n'y a, de ce fait, aucune difficulté.

18. Cas d'un mélange de deux alcools. — Jusqu'ici, nous avons supposé que nous n'avions affaire qu'à un seul alcool, de la série grasse. Lorsqu'il y en a deux ou plusieurs, le problème devient plus difficile à résoudre. Il faut pourtant distinguer tout de suite le cas où le second alcool n'intervient qu'à l'état d'inqjuretés, de celui où il est en proportions voisines de celles du premier. Dans le premier cas, on est averti du mélange parce que le nombre de gouttes n'est d'accord avec la densité pour aucun des alcools, mais s'en rapproche beaucoup pour l'un deux, se tenant au-dessous si l'impureté est due à un alcool de degré inférieur, au-dessus si c'est un alcool de degré supérieur.

I\Ih:TIlODES DE l)OSA(il-: 33

Quand les corps mélangés à l'alcool principal de la fermentation sont en proportion très faible, aucun dosage au compte-gouttes n'en peut indiquer la nature. Il faut alors avoir recours à leurs réactions qualitatives et renoncer, d'ordinaire, à tout dosage. Mais quand il n'y a que deux alcools mélangés, et que leurs proportions sont comparables, on peut trouver leurs poids respectifs avec une assez grande approximation, à l'aide du tour de main que voici :

Amenons le mélange, par une distillation ou une affusion d'eau convenable, soit à marquer une certaine densité absolue, soit, ce qui est plus pratique, à marquer un même degré à l'alcoomètre. Il nV aura plus, il est vrai, correspondance exacte entre le degré alcoométrique et la densité, car l'alcoomètre n'est gradué que pour l'alcool éthylique, et, plongé dans un autre alcool dont la tension superficielle, pour une certaine densité, est plus faible que pour l'alcool ordinaire, il se relèvera davantage à cause de la diminution dans TefFet du ménisque autour de la tige; donc, pour lui faire marquer le même degré que dans l'alcool ordinaire, il faudra rendre le liquide moins dense, c'est-à-dire y ajouter plus d'alcool. Il n^y a par suite plus de correspondance entre les densités des mélanges et leur degré alcoométrique, mais cela nous importe peu, du moment que nous ne cherchons qu'un moyen empirique de dosage.

Ces mélanges, amenés au même degré alcoométrique, et étudiés au compte-gouttes, donnent des nombres de gouttes variables avec leur composition, de sorte que si on dresse d'avance une table indiquant le nombre de gouttes de divers mélanges artificiels, amenés aussi à marquer le même titre alcoométrique, cette table donnera la composition du mélange inconnu dont on connaîtra seulement le nombre de gouttes.

Je n'ai pas cru devoir dresser d'avance toutes les tables dont on peut avoir besoin, d'abord parce que ces tables

34 CHAPITUK K

peuvent varier suivant l'alcoomètre dont on se sert, la dimension de sa tige et la façon de relever le niveau d'affleurement. Elles sont tellement faciles à construire, que chacun peut se faire celles qui conviennent à son instrument et à son mode de lecture. Mais les variations provenant de ce fait ont peu d'importance, et on peut, si on veut, se contenter des deux tables suivantes, qui se rapportent aux mélanges qu'on est exposé à rencontrer le plus souvent, ceux de l'alcool butylique et de l'alcool amylique avec l'alcool ordinaire.

MÉLANGES d'aLCOOL BUTYLIQUE AVEC l'aLCOOL ÉTHYLIQUE AMENÉS A MARQUER 5° A l'aLCOOMÉTRE G.-L.

Nombre de gouttes r/u mélange

Alcool ord.

Alcool hutyl.

La table est dressée pour la température de 15" ; elle a été faite avec de l'alcool butylique de fermentation. On voit que la dissolution de cet alcool qui marque 5° à l'alcoomètre contient en réalité 6,5 0/0 d'alcool.

METHODES DE DOSAGE 3o

MÉLANGES d'alcool AMYLIQUE AVEC l'aLCOOL ËTHYLIQUE AMENÉS A MARQUER 5° A l'aLCOOMÉTRE G.-L.

Noml)re de gouttes du mélange

Alcool ord. 0/0

Alcool amyl. 0/0

2iii

On voit que de très petites quantités d'alcool amylique mélangées à l'alcool ordinaire augmentent beaucoup le nombre de gouttes, sans rien changer non pas à la densité, mais à l'indication alcoométrique. Le dernier chiffre obtenu correspond à peu près au maximum de solubilité de l'alcool amylique dans le mélange maintenu à 5° G. L.

Reste à ne pas confondre l'alcool butylique et l'alcool amylique ; mais les différences d'odeur et de solubilité de ces deux alcools (surtout quand, après avoir soumis le mélange à la distillation, on étudie à ce point de vue les premières portions du liquide distillé), ces différences sont telles qu'il n'y a jamais de doute à avoir, à moins que l'un des alcools supérieurs ne soit en proportions très faibles, auquel cas il faudrait recourir aux réactions chimiques qui permettent de le caractériser.

En somme, nous avons donc le moyen de doser un mélange d'alcools, et avec une approximation assez grande. La méthode serait même parfaite, à cause de sa sensibilité, si elle n'avait le grave défaut de ne s'appliquer qu'à un

36 CIIAPITllR II

mélange de deux alcools. Sitôt cju'il y en a trois, on ne peut plus compter sur rien. Heureusement ces mélanges de trois alcools sont rares. Ceux de deux alcools ne sont même pas communs, et généralement l'un des deux est en faible proportion. C'est pour cela que, dans les tableaux qui précèdent, j'ai donné plus d'importance aux faibles doses des alcools supérieurs.

Pour des doses très faibles d'alcool ordinaire, inférieures à deux millièmes, le compte-gouttes n'est plus assez sensible. Il y a heureusement pour ces cas une méthode proposée en 1896 par M. Nicloux.

19. Méthode de M. Nicloux. — Cette méthode repose sur le fait suivant. Si dans une solution très diluée d'alcoo], et inférieure à 0,2 0/0, on verse une solution étendue de bichromate de potasse et d'acide sulfurique^ l'alcool est oxydé, et le bichromate devient du sulfate de scsquioxyde de chrome, qui est vert bleu. Aussitôt que l'alcool est oxydé, le bichromate reste en excès, et la teinte passe au vert jaune. On a donc un virage assez sensible, et dans ces limites, la quantité de bichromate oxydé est à très peu près proportionnelle à la quantité d'alcool présente dans la liqueur.

Voici alors le mode opératoire, perfectionné par MM. Béhal et François. On fait une solution de 19 gr. par litre de bichromate de potasse cristallisé, et on la verse au moyen d'une burette graduée dans 5 ce. du liquide alcoolique à étudier, contenu dans un tube à essai. On en ajoute 3 ou 4 gouttes^ et on verse 5 à 6 ce. d'acide sulfurique pur à 66" Baume. La liqueur s'échauffe, et le bichromate introduit se décolore. On en ajoute de nouveau en maintenant le tube à l'ébullition et en agitant un peu. On s'arrête au moment où la teinte passe du vert bleu au vert jaune. On note le volume de bichromate. S'il y a moins de 2 ce. versés, l'alcool est à moins de 2 p. 1000 dans la liqueur à essayer : sinon il faut recom-

mencer après avoir étendu d'eau cette liqueur, de façon à l'amener à la dilution voulue. Pour les solutions à moins de 0,1 0/0, il vaut mieux employer une solution de bichromate deux fois moins concentrée. On peut, pour plus de sûreté, faire une seconde expérience témoin dans laquelle on ajoutera d'un coup la dose de bichromate introduite dans la première, moins une ou deux gouttes. Dans celleci, ce liquide devra rester vert bleu. Comme il faut 2 ce. de la solution de bichromate à 19 gr. par litre pour oxyder l'alcool de 5 ce, d'une solution à 2 p. 1000, le chiffre lu sur la burette représente le nombre de millièmes d'alcool contenu dans la liqueur à doser. Comme l'erreur de lecture est au maximum de 0,1 ce, ou de 1/20 du volume total, on voit qu'on peut doser environ un dix-millième d'alcool, et comme 5 ce. de liquide suffisent à la rigueur à l'expérience, la quantité d'alcool qu'on peut mesurer est de cinq dix-millièmes de centimètre cube. Aucune méthode n'arrive jusque-là.

Malheureusement celle-ci a ses défauts. Rien ne dit que l'alcool soit le seul réducteur possible du bichromate dans les conditions étudiées. M. Nicloux s'est bien assuré que l'aldéhyde était sans action. Mais il n'a pas cherché si les autres alcools ne se comportaient pas comme l'alcool ordinaire. La réaction est une oxydation qu'on peut écrire de la façon suivante :

c^H^o + 0^ = c^H*o^ H- iro

Mais cette formule n'est pas tout à fait conforme à la réalité, attendu qu'elle ne comporte aucun dégagement d'acide carbonique, tandis qu'il s'en fait en réalité^ comme le constate M. Nicloux, une quantité correspondant à 1 ou 2 0/0 du carbone total, et c'est là une cause d'erreur qui rend un peu vaine la précision du dosage. En second lieu, l'expérience montre que lorsque dans un membre d'une famille chimique, un groupement atomique est attaqué par un oxydant, le même groupement est attaqué de la JM^nî^;-->,

façon chez les autres membres. Il aurait donc fallu savoir si l'alcool propylique, amyliquc, ne donnent pas de l'acide propionique, de l'acide valérianique, exactement comme l'alcool ordinaire donne de l'acide acétique, sans dégagement d'acide carbonique. On sait que cela a lieu pour des solutions peu étendues ; on s'est môme servi de cette propriété pour substituer au dosage des divers alcools celui des acides gras qu'ils donnent par oxydation. Mais la formule de la transformation n'a jamais été établie avec précision 2)our des solutions très diluées, et de ce côté il y a donc quelques incertitudes. La méthode de M. Nicloux n'en est pas moins très utile dans quelques cas où il n'y a pas de doute à avoir sur la nature de l'alcool dont on cherche les proportions, et c'est pour cela que nous lui avons fait une place ici.

SO. Dosage des acides fixes. — Les acides fixes provenant de procès fermentatifs sont probablement bien plus nombreux que nous ne le croyons aujourd'hui, où on ne peut guère citer comme ayant cette origine que l'acide oxalique, l'acide succinique, l'acide lactique, l'acide citrique. Pour les trois premiers, les procédés de dosage sont connus. Nous avons développé dans notre tome III un procédé de dosage de l'acide succinique en présence des acides fixes du vin. On ne connaît malheureusement aucun moyen de faire la séparation exacte de l'acide lactique et de l'acide succinique, qui sont souvent mélangés. Le meilleur est celui qu'ont employé MM. Gayon et Laborde dans un travail que nous rencontrerons plus loin. Il s'applique à des mélanges d'acide lactique, d'acide succinique et d'acides volatils. Il est, dans une certaine mesure, à la fois qualitatif et quantitatif, et voici en quoi il consiste.

31. Dosage des acides fixes dans un mélange d'acide lactique et d'acide succinique. — On concentre au bainmarie 300 ce. de liquide fermenté ; les acides gras se vola-

tilisent. On ajoute ensuite du sable calciné au produit sirupeux ainsi obtenu et l'on traite successivement, à froid, ou à chaud dans un appareil à déplacement, par l'éther seul^ et par un mélange d'éther rectifié et d'alcool absolu à parties égales On" réunit les liqueurs et on évapore les dissolvants ; il reste un liquide sirupeux qu'on abandonne pendant quelques jours dans une atmosphère sèche, et qui ne tarde pas à se remplir de cristaux blancs, j)ailletés et légers. On lave ces cristaux avec une solution saturée et glacée d'acide succinique pur, qui enlève l'acide lactique et la glycérine s'il y en a ; comme ces cristaux sont légers et difficiles à mouiller, ils flottent en partie sur la solution succinique ; aussi pour les séparer ne peut-on pas se contenter de décanter celle-ci, comme on le fait pour le dosage de la crème de tartre par le procédé Pasteur; il faut les recueillir sur un filtre.

Après le lavage, le filtre est d'abord bien égoutté, puis séché dans le vide sulfurique ; les cristaux se détachent alors facilement et on peut les peser. Si l'on desséchait le filtre dans une étuve, on s'exposerait à voir les cristaux disparaître par redissolution dans l'eau qui imprègne encore le papier du filtre.

On sépare encore les cristaux avec facilité en jetant tout le magma sur une plaque poreuse ; quand toute la partie liquide a été absorbée, on lave avec une petite quantité de solution saturée froide d'acide succinique.

SS. Reclierclie de l'acide citrique. — Pour l'acide citrique, produit curieux de l'action de quelques ferments que nous rencontrons dans ce livre, il y a une réaction très sensible qui permet de la déceler. Elle a été récemment proposée par M. Denigès, et repose sur ce fait que les produits d'oxydation de l'acide citrique par les oxydants manganiques, en milieu acide, donnent, en présence du sulfate mercurique, une combinaison mercurielle insoluble qui, dans certaines conditions, est spécifique de l'acide citrique.

u) ciiAiMTni-: II

Le procédé consiste à mélanger o ce. d'une solution contenant ([uelques milligrammes d'acide citrique et 1 ce. de sulfate mercurique, préparé de la façon suivante :

Oxyde mercurique (jaune ou rouge)... 5 gr.

Acide sulfurique concentré 20 ce.

Eau distillée 100 ce.

On porte, à Tébullition, et, retirant du feu, on ajoute

5 à 6 gouttes d'une solution à 2 0/0 d'hypermanganate de potassium. Le mélange se décolore et il se forme aussitôt après un trouble et un précipité blanc.

Par exemple s'il s'agit de montrer la présence de l'acide citrique dans un lait, on met dans un tube 10 ce. de lait, 2 ce. d'une solution récente de métaphosphate de sodium à 5 0/0, récemment préparé, et 3 ce. de sulfate mercurique. On agite et on fdtre en rejetant les premières portions écoulées, souvent louches. On porte à l'ébullition 5 à

6 ce. On fdtre, on enlève du feu, et on ajoute goutte à goutte, en agitant chaque fois, du permanganate de potassium à 2 p. 100. Avec le lait de vache, on obtient, après addition de 4 à 5 gouttes de ce réactif, un trouble blanc très marqué, et à 8 ou 10 gouttes, il se fait un précipité blanc floconneux.

Cette réaction ne réussit avec aucune des substances qui peuvent accompagner l'acide citrique, acides acétique, tartrique, oxalique, succinique, lactique, la glycérine, les gommes, le glucose, fructose^ saccharose, lactose. Ceux de ces corps les plus facilement oxydables, notamment les acides malique, tartrique, lactique protègent seulement un peu l'acide citrique contre l'oxydation, et il faut, en leur présence, forcer la dose d'hypermanganate versée à l'origine.

Avec l'acide nitrique, il se forme non pas de l'acétone CIF.CO.CtP, comme on pourrait le croire, mais de l'acétone dicarbonique (pii donne facilement la combinaison mercui'ielie insoluble que nous venons d'utiliser.

33. Rech.erch.e des acides lactique et glycolique. — M. Denigès a aussi donné une méthode permettant de caractériser les acides lactique ou glycolique, seuls ou mélangés. En milieu acide ou même neutre, ces deux acides donnent une aldéhyde en présence du peroxyde de plomb suivant les équations suivantes :

(:H\CH0II.C0^II 4- 20 = GH^COH + IPO + co^

acide hirtiquo ethaiial

GIPOtl.CO'H + 20 = C.COH + HO -\- CO'

acide 1,'lycolique niétliunul

Les deux aldéhydes sont reconnaissables à leur action sur le nitrate d'argent ammoniacal à chaud. Elles se distinguent l'une de l'autre en ce que la première donne et que l'autre ne donne pas la réaction de Légal, par le nitroprussiate de soude. Le méthanal ou formol réduit au contraire le sulfate mercuriquc à l'état de sulfate mercureux insohible.

BIBLIOGRAPHIE

DcjCLAux. Armales de l'Institut Pasteur, t. IX, p. 575, 1895.

LiNDET. Revue générale de Chimie, t. IV, p. 300, 1901.

NicLoux. Comptes-rendus de la Soc. de Biologie, t. III. 1896.

Béhal et François. Journ. de Pharmacie et de Chimie, l" mai 1897.

Gayon et Laborde. Ann. de l'Inst. Pasteur, juillet 1901.

Denigès. Soc. des Se. phys. et nat, de Bordeaux. 1897 et, 1898.

GHAPITUE III

BACILLE .AMYLOZY^IE

Les notions générales que nous avons rassemblées dans les deux chapitres qui précèdent nous permettent de passer à l'étude des divers ferments. Nous commencerons par celui des bacilles anaérobies dont les fonctions sont les mieux connues, grâce au soin mis par le savant qui l'a étudié, M. Perdrix, à doser tous les corps liquides et gazeux produits par la fermentation. Nous avons déjà eu occasion de le prendre comme exemple, à ce point de vue, dans le tome I de cet ouvrage (p. 224). Nous devons en faire en ce moment l'histoire approfondie.

94. Origine et purification du bacille. — Ce bacille a été rencontré, avec un grand nombre d'autres, dans Teau de l'Avre et celle de la Seine. Gomme nous allons lui trouver des fonctions physiologiques assez variables, il importe d'être assuré qu'il constitue bien une espèce unique, et qu'on n'a pas confondu sous son nom des espèces diflerentes, ce qui expliquerait la variabilité des produits. D'un autre ccMé, comme il est tout à fait anaérobie, sa purification est difficile. Voici comment M. Perdrix y a procédé.

Il commence par ensemencer une goutte d'eau de Seine daus des tubes contenant une macération stérilisée de fragments de pomme de terre. Le vide étant fait dans ces tubes, une fermentation avec dégagement gazeux s'y déclare. iVprès 8 à 10 jours, on aspire une goutte de cette culture dans un tube capillaire qu'on maintient pendant 10 minutes à 78-80°. Ce liquide chauffé est ensemencé à nouveau

BACILLE AMYLOZYME 43

dans des tubes à pomme de terre : on élimine ainsi les micrococcus et une partie des bacilles de l'eau ; on ne laisse que ceux dont les spores résistent 10 minutes à la température de 80".

On ensemence alors en strie, avec nn fil de platine, une goutte de cette seconde culture purifiée sur des fragments de pomme de terre contenus dans les tubes de Roux (t. I, p. 124), et après avoir fait le vide, on met à l'étuve. Au bout de quelques jours, si la quantité de semence n'a pas été trop considérable, on aperçoit sur les tranches de pommes de terre des taches séparées. Les colonies du bacille cherché sont d'abord un peu blanches ; elles s'élargissent en s'agrandissant circulairement, et forment de petits mamelons, autour desquels le substratum est un peu creusé. En môme temps, la pomme de terre parait partiellement liquéfiée, et le liquide qui s'en écoule se rassemble à la partie inférieure du tube.

Quand on ouvre les tubes de culture, il y a explosion, et, par suite de la diminution de pression, toutes les colonies abandonnent le gaz qu'elles renferment : sur chacune d'elles, il se forme de petits cratères laissant échapper des bulles.

Si l'on a le soin de choisir un tube contenant une ou deux colonies, et de prendre dans l'une d'elles une trace de semence, on est à peu près sûr d'obtenir une masse de microbes provenant originairement d'un bacille unique.

La certitude n'est pas complète ; car il pourrait se faire que la colonie fût due à un paquet formé de plusieurs germes agglutinés. Pour être certain de la pureté, il est prudent de faire une séparation nouvelle sur gélatine, qui est moins favorable au bacille que la pomme de terre, et qui, en cas de mélange, laisserait d'autres espèces se développer plus facilement que lui. On dilue dans de l'eau une goutte de culture purifiée, et on porte une goutte de cette dilution dans un tube de gélatine liquéfiée par la chaleur. Dans ce tube on fait passer pendant 2 à

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3 heures un courant d'hydrogène, de façon à enlever tout l'oxygène. On y prélève alors, sans interrompre le courant gazeux, à l'aide de pipettes à longue effilure, quelques gouttes de liquide. On ferme à la lampe les effilurcs, et au bout de o à 6 jours on voit apparaître dans la gélatine de petites taches blanches, distinctes, donnant naissance ;\ un dégagement gazeux. On coupe le iube au niveau de l'une d'elles, et c'est avec cette semence qu'on peut commencer l'étude physiologique.

S5. Caractères généraux. — Le bacille amylozyme, sur la pomme de terre et dans les milieux ordinaires de culture, est mobile, et a environ 2 à 3 ul de longueur et 0,5 [JL de largeur ; il est arrondi à ses extrémités. Il se réunit par couples ou par chaînes, dout les mouvements sont d'autant plus lents qu'elles sont plus longues. Cette mobilité est diminuée et même arrêtée complètement par la présence de l'oxygène de l'air.

Il donne des spores, qui ont leurs caractères ordinaires, et finissent par se mettre en liberté, par résorption du filament qui les contenait.

Dans aucun milieu, même dans ceux qui lui conviennent le mieux, il ne peut pousser à l'air ; dans le vide, au contraire, il est facile d'obtenir un développement ; il en est de même dans l'hydrogène, l'azote ou l'acide carbonique.

Bien qu'il soit anaérobie, il est possible de le faire pousser à l'air en ensemençant, dans la profondeur du liquide sur lequel on opère, une quantité notable de culture fraîche.

36. Conditions de température. — La température la plus favorable pour obtenir une culture rapide est de 35" environ.

De 20 à 25", l'amylozyme pousse encore très bien ; seulement, la fermentation ne débute pas aussi tôt, et elle est plus lente.

BACILLE AMYLOZYME 4o

Vers 16 ou 17", il n'y a aucun développement le deuxième jour ; le troisième, quelques bulles de gaz apparaissent, et, le quatrième, la fermentation est manifeste ; elle s^arrête au bout d'une quinzaine de jours.

La température ne doit pas non plus être trop élevée : des tubes placés à 50'\ 45", 44o n'ont pas poussé. A 42''-43", il y a toujours fermentation.

Dans ces conditions limites, le bacille donne des spores comme à 35'' : il se trouve cependant dans de mauvaises conditions de vie ; car, si l'on ensemence quelques gouttes de cette première culture dans de nouveaux tubes à la même température, ceux-ci restent généralement stériles. Mais la spore n'est pas tuée, car des tubes restés sans culture pendant dix jours à 50", et remis ensuite à létuve à 35o^ ont poussé aussi rapidement que d'autres nouvellement ensemencés.

Les spores résistent dix minutes à 80». Elles sont aussi assez résistantes à l'action du temps : des germes conservés pendant cinq à six mois dans une culture sur pommes de terre peuvent se développer à nouveau, bien qu'avec un peu de retard. Il serait difficile de dépasser ce terme avec les cultures ordinaires, qui sont toujours légèrement acides.

Dans un milieu neutre^ au contraire, la durée de conservation est beaucoup plus considérable, et des germes peuvent donner naissance à de nouvelles cultures au bout de dix-huit mois.

S"?. Milieux de culture. — Le bacille amylozyme se développe bien dans les liquides ordinairement employés en microbiologie, par exemple, dans le bouillon de veau acide ou neutralisé ; mais les cultures s'arrêtent assez rapidement : elles durent deux ou trois jours à 35".

Il fait fermenter les sucres, agit énergiquement sur la matière amylacée, mais n'a pas d'action sur la cellulose et sur le lactate de chaux.

Ces propriétés le difFérencient de \ amylohacter de M. Van Tieghem et du vibrion Ijutyrique de M. Pasteur.

Si Ton détermine la réaction des milieux variés dans lesquels il a poussé, on constate que dans tous la culture s'arrête toujours quand l'acidité du liquide atteint un taux déterminé, équivalent à 1 er. ou 1,2 gr. SO'H" par litre.

Comme ce bacille transforme en acides lés sucres et l'amidon, on ne pourra donc avoir de fermentation complète qu'en arrêtant l'acidité avant cette limite. Il suffira pour cela d'ajouter du carbonate de chaux dans les vases, de façon à neutraliser à chaque instant les acides formés.

L'acidité nécessaire pour empêcher le commencement du développement de l'amylozyme sur la pomme de terre est plus faible que celle dont le bacille s'accommode à la fin de la culture : elle n'est que de 0,55 gr. SO^H' par litre.

Les milieux trop alcalins ne conviennent pas non plus à l'amylozyme : il ne se développe pas quand la dose initiale de potasse atteint 0,8 gr, par litre.

Dans ces liqueurs alcalines, l'acide formé ne tarde pas à saturer la potasse ; la culture s'arrête encore quand l'acidité atteint la limite ci-dessus indiquée : 1,1 gr. par litre.

28. Dégagement de gaz. — D'une façon générale, la fermentation des sucres donne lieu à un dégagement considérable d'un mélange gazeux formé d'acide carbonique et d'hydrogène.

Mais si la nature des gaz dégagés reste constante, leur proportion varie avec les ditlerents sucres qui servent d'aliment au microbe, et, pour le même milieu, avec l'âge de la culture.

En même temps, les sucres sont transformés en acides butyrique et acétique ; et ce mélange est variable également aux différents moments du développement du bacille.

Pour étudier la relation entre la composition des gaz dégagés et celle des acides formés, il faut pouvoir faire

BACILLE AMYLOZYME il

des cultures en grand. On peut employer pour cela le dispositif suivant :

On prend un ballon à fond plat de 1 litre 1/2, fermé par un bouchon à deux trous. Le premier laisse passer un tube recourbé horizontalement et descendant jusqu'à la partie inférieure du vase ; il renferme un tampon de coton. L'autre contient un tube court, traversant simplement le bouchon, et contenant également un peu de coton.

On introduit environ 3/4 de litre de bouillon sucré, avec un peu de carbonate de chaux pulvérulent ; on stérilise le tout à l'autoclave à 115° pendant 10 minutes et on laisse refroidir.

On ensemence par le petit tube, sur lequel on adapte un tube à dégagement ordinaire et on fait ensuite passer par le tube recourbé un courant d'azote, pour enlever tout l'air du ballon et du liquide qu'il contient. Puis on met à l'étuve. Quand le dégagement gazeux se produit, on en profite pour faire sortir du ballon la quantité de liquide nécessaire pour l'étude. On peut donc suivre simultanément les changements de composition des produits liquides et gazeux de la fermentation.

Nous avons dit qu'il se dégageait un mélange à proportions variables d'acide carbonique et d'hydrogène. De cet acide carbonique, une partie provient, non de la matière fermentescible, mais du carbonate de chaux décomposé par les acides produits. On peut évaluer assez exactement l'acide carbonique de cette dernière provenance en mesurant quelle est au même moment la quantité de chaux dissoute dans le liquide à l'état de sel. La soustraction faite de cet acide carbonique de la craie, il reste celui dont le carbone provient de la matière organique.

Pour ce dernier, il importe de remarquer que^ comme il est beaucoup plus soluble dans l'eau que l'hydrogène, les gaz qui se dégageront à l'origine n'auront pas la composition du mélange produit par le microbe. L'hydrogène dominera dans le mélange qui sort du ballon, Facide car-

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boniquc clans le mélange (|ui y reste. La correction à faire pour conclure de la composition tlu mélange recueilli celle du mélange réel n'est pas facile à faire d'une façon précise, et il y a toujours de ce côté quelque incertitude. En gros, on peut admettre que le liquide du ballon retient son volume d'acide carbonique et ne retient pas d'hydrogène. Mais quand on veut opérer avec quelque précision, il faut faire une fermentation dans le vide.

S9. £;tude d'une fermentation. — C'est ce qu'a fait M. Perdrix pour l'expérience que nous allons résumer. 50 ce. d'un liquide contenant 2 gr. 44 de sucre candi blanc, dissous dans du bouillon de veau neutralisé et additionné de carbonate de chaux, sont introduits dans des ballons clos qu'on met à l'étuve à 35°. Le lendemain, la fermentation commence : à divers intervalles, on prélève un des ballons, on en extrait les gaz au moyen de la pompe à mercure, et on fait l'analyse du liquide et des gaz dégagés. De l'acide carbonique obtenu, on défalque celui qui provient de la décomposition du carbonate de chaux, et on en conclut celui qui provient de la fermentation du sucre. Quant au liquide, on y trouve exclusivement de l'acide butyrique et de l'acide acétique.

Voici, pour fixer les idées, les volumes V, évalués en centimètres cubes, des gaz dégagés à divers intervalles après l'ensemencement. Pour l'acide carbonique, on a fait la distraction de celui qui provenait du carbonate de chaux. La colonne R donne le rapport des volumes ; la colonne D les différences des chiffres de la colonne Y ; c'est-à-dire les quantités dégagées dans les intervalles de deux expériences consécutives :

Tcmiis Ilydrng. Ac. carli.

3 jours 175 85

4 jours 275 145

5 jours ooO îiO

11 jours (>70 450

Ilytlrog.

Ac. larh.

BACIIJJ-: AMVLoZYME 4;>

En consultant ce tableau, on voit qu'au début de la fermentation, il se dégage beaucoup plus d'hydrogène que d'acide carbonique, environ le double. On peut en conclure, en partant de ce que nous avons vu au chapitre premier, que la fermentation butyrique ne se fait pas suivant la formule classique, dans laquelle les volumes d'hydrogène et d'acide carbonique dégagés sont égaux, mais suivant une formule pkte complexe^ qui exige la décomposition de l'eau.

A mesure que la fermentation se poursuit, les volumes des deux gaz tendent à s'égaliser. Ils sont égaux dans le cas ci-dessus à partir du 4e jour, et le restent jusqu'à la fin, car, jusqu'à plus ample informé, on ne peut pas s'arrêter à la petite différence que présentent les deux derniers chiffres de la colonne D. Donc, à la fin nous avons affaire à la fermentation butyrique classique.

Le rapport de l'acide butyrique à l'acide acétique, trouvé dans l'analyse, faite à divers intervalles^ du liquide de fermentation, doit donc aller en croissant, l'acide acétique étant formé surtout au début, lorsque se fait simultanément cette décomposition de l'eau qui fournit l'excédant d'hydrogène. L'hydrogène se dégageant, l'oxygène de l'eau accomplit une véritable combustion intérieure dont l'acide carbonique et l'acide acétique sont les produits. Il est curieux de voir un microbe emprunter l'oxygène à l'eau pour produire des combustions nouvelles, et comme l'acide acétique, pris en bloc, est moins oxygéné que l'eau et plus complexe, il en résulte que si au regard du sucre, pris pour point de départ de son carbone, il représente un produit de dislocation, au regard de l'eau, pris pour point de départ de son oxygène, il constitue un produit de synthèse. Ici nous voyons l'utilité de cette analyse fine qui nous permet de mettre en lumière ces conclusions.

Voyons maintenant si l'analyse du liquide les confirme.