FIXÉES ET COLORÉES

Les préparations fixées et colorées sont indispensables pour étudier d’une façon complète la cytologie des Entamibes et notamment les détails de la structure des noyaux, au repos et en

division.

Dans un simple but de diagnose, elles ne sont, pas toujours nécessaires. On devra cependant parfois y avoir recours lorsque l’examen à l’état frais se sera montré insuffisant à révéler les caractères sur lesquels on s’appuie pour distinguer les deux

Entamibes intestinales. .

Nous n’étudierons que les procédés de fixation et de coloration nui de l’avis des protistologues, donnent les meilleurs résultats.

i» Procédés de fixation. - Tous les procédés de fixation à sec sont à rejeter. Les frottis doivent toujours être fixés à l état humide.

On étendra en couche mince, de préférence sur lamelles, au moyen d’un fil de platine ou d’un pinceau fin et mou, le matériel contenant des amibes. Cet étalement doit être fait délicatement de façon à ne pas écraser les protozoaires. Il exige un certain tour de main et un peu d’habitude, car la couche ne doit être ni trop mince pour éviter une brusque dessiccation, ni trop épaisse, ce qui

nuirait à une bonne fixation. ..

Pendant tout le temps de l’étalement, il sera quelquefois utile de tenir les frottis non loin de la bouche pour les maintenir avec

l’haleine dans un état d’humidité suffisante.

Pour faciliter l’adhérence des kystes au verre on se trouvera bien d’ajouter au matériel d’étude une très petite quantité de sérum ou d’une solution d’albumine de Mayer.

On fera flotter ensuite le frottis encore humide, et face en-des-

sous, sur le liquide fixateur.

fixateurs. — Un assez grand nombre de fixateuis oui été re commandés. Deux suffisent à tous les besoins : le liquide de Schaudinn et le liquide de Bouin-Duboscq .

a) Fixa%ur de Schaudinn au sublimé- alcoolo-acétique . —

Ce liquide se compose de :

Solution aqueuse saturée de sublimé. . . .

Alcool absolu

Acide acétique 1 à u2 % du volume total.

2 volumes.

■1 volume.

11 n’y a pas d’inconvénient à remplacer l’alcool absolu par de l’alcool à g5°.

Le mélange est chauffé vers 5o° au moment de l’emploi.

La fixation demande environ un quart d’heure. On transporte ensuite dans la série des alcools en commençant par

Alcool a 40°.. -10 minutes.

Alcool à 70» iodé (teinte vieux cognac) il) minutes.

Alcool à 00° 20 minutes.

Alcool à 40° 15 minutes.

On rince ensuite soigneusement à l’eau et on procède à la coloration.

b) Fixateur de Bonin- Duboscq. — Ce fixateur est excellent. Il convient très bien si l’on doit colorer ensuite par le Mann, mais on obtient également de bons résultats avec l’hématoxyline-ferrique-éosine.

Sa formule est la suivante :

Acide picrique cristallisé 1 gr.

Formol commercial à 40 0/0 60 cc

Alcool à S0o 150 cc’

Au moment de l’emploi on ajoute à ioo cc. du mélange :

Acide acétique glacial 7 cc.

Les frottis sont immergés dans ce fixateur pendant au moins 20 minutes. Il n’y a aucun inconvénient à les y laisser plusieurs heures .

Au sortir de ce fixateur, on lave à plusieurs reprises dans l’alcool à 70° puis dans l’alcool à 3o° ; finalement on lave à l’eau. On colore ensuite soit par l’hématoxyline-ferrique de Heidenhainéosine, soit par la méthode de Mann.

20 Procédés de coloration. — - a). Coloration à l’hé/natoxylineferrique de Heidenhain. — La coloration à l’hématoxyline-ferrique est la méthode cytologique fondamentale. C'est elle qui donne incontestablement les meilleurs résultats pour l’étude des amibes. Il n’y en a pas qui lui soit supérieure. Malgré son apparente complexité, elle donne sans difficulté des préparations très belles et très lisibles.

Cette méthode nécessite une solution aqueuse d’alun de fer et une solution d’hématoxyline.

i° Solution d’alun de fer :

Alun do 1er (Sullate doubled’ammonium et de sesquioxyde defer). 4 gr.

Eau distillée 100 cc.

Faire la solution à froid et ne pas en préparer une trop grande quantité à la fois .

Il faut choisir les cristaux d’alun de fer violet clair ; s’ils ont pris une teinte jaunâtre, ils sont altérés etne peuvent être utilisés.

20 Solution d’hématoxyline :

TECHNIQUE POUR L’ÉTUDE DES AMIBES

llématoxyline puriçaiine

Alcool absolu

Eau distillée

1 gramme.

10 cc.

190 cc.

Cette solution doit mûrir quelques jours. Elle devient noire lorsqu’on y a plongé des frottis imprégnés d’alun de fer, mais elle est néanmoins utilisable pendant longtemps.

11 nous faut maintenant énumérer les divers temps du mordançage de la coloration et de la différenciation.

Les frottis, au sortir de l’alcool à 4o°, sont lavés quelques minutes dans l’eau de robinet, puis à l’eau distillée.

io On les immerge dans la solution d alun de ter et on les y

laisse au moins deux heures;

2° On rince rapidement a 1 eau distillée ,

3° On colore dans la solution aqueuse d’hématoxyline pendant

12 à a4 heures; ' .

A la sortie de ce bain colorant les frottis sont complètement

noirs.

4° On lave à l’eau distillée quelques instants ;

50 On différencie dans une solution faible d’alun de fer à environ i p. ioo. Ce temps est le plus délicat. De temps en temps on sort les préparations, on les rince a 1 eau distillée et on examine a un grossissement approprié le degré delà différenciation. Si elle est Insuffisante, on plonge de nouveau dans la solution d’alun de fer, sinon on lave soigneusement, et, s’il y a lieu, on fait suivre d’une coloration plasmatique, par exemple à l’éosine.

On utilise une solution aqueuse d’éosine B. A. qu’on laisse agir quelques secondes. Les frottis sont ensuite lavés à l’eau et passés dans la série des alcools à 3o°, 90» et absolu pour être dés-

hydratés ; finalement on les porte dans le xylol, puis on monte ^au baume de Canada.

Au lieu de faire une simple coloration plasmatique par l’éosine on peut se servir d’un mélange de Litchgrün F. S. et d’éosine W. G. de Grübler.Les deux colorants sont mis en excès dans de

l’alcool à 90°.

Après un séjour de cinq minutes dans cette solution colorante, on différencie par l’alcool absolu, additionné d’acide acétique dans la proportion de 5 °|0, jusqu’à l’apparition de la teinte verte. Cette double coloration plasmatique, qui est une simplification de la méthode de Prenant, différencie avec une grande précision les inclusions contenues dans les vacuoles du réseau cytoplasmique. Les inclusions colorées en vert brillant tranchent sur la teinte rose du cytoplasme (Citatton).

1)). Procédé rapide de Wallcer à l'hématùxijline. — Après fixation au sublimé- alcoolo-acétique durant une dizaine de minutes, on lave soigneusement ù. 1 eau distillée et on coloie de

• > à ;> minutes dans la solution suivante (préparée une quinzaine de jours à l’avance) :

Hématoxyline.. .

Solution aqueuse saturée d’alun ammoniacal. iOO cc

Eau distillée. I ' I . ! 1 1 300 cc.'

thymol, un fragment.

On lave ensuite la préparation à l’eau distillée et on passe dans la série des alcools pour déshydrater, finalement, après passage dans le xylol, on monte au baume en ayant soin de recouvrir avec une lamelle très mince.

c). Coloration de Mann. — Cette méthode de coloration s’emploie surtout après fixation au liquide de Bouin-Duboscq. On peut la réaliser de plusieurs manières ; je n’en indiquerai que deux.

A. Procédé lent. — i° Colorer pendant 12 à -il\ heures à la température du laboratoire ou durant 2 heures à l’étuve à 37° dans le mélange suivant :

Bleu de méthyle à 1 0/0 dans l’eau distillée 35 ce.

Eosine à 1 0/0 dans l’eau distillée 45 ce.

Eau distillée 100 ce

2° Rincer rapidement à l’eau pour enlever l’excès de colorant.

3° Déshydrater dans l’alcool absolu.

4° Différencier à l’alcool alcalin.

Alcool absolu 50 ce.

Potasse caustique à 1 0/0 dans l’alcool absolu. 7 gouttes.

5° Quand le frottis est devenu rougeâtre, laver à l’alcool absolu pour enlever toute trace d’alcali.

6° Différencier l’éosine dans l’alcool à 900.

70 Plonger dans :

Alcool à 90° 50 cc.

Acide acétique V gouttes.

Le frottis redevient bleu.

8° Continuer la déshydratation par l’alcool absolu, puis xylol, baume.

B. Procédé rapide (communiqué par M. Chatton). — Dans un flacon contenant de l’eau distillée on met en excès les deux colorants suivants : bleu de méthyle et éosine W. G. de Grübler.

On laisse dissoudre et déposer. Le liquide, après décantation, constitue la solution colorante.

i° Les frottis sont plongés dans cette solution de5à r5 minutes;

2° Laver rapidement à l’eau.

Ce simple lavage à l’eau peutgêner ultérieurement la différenciation. Certains auteurs déconseillent ce temps.

TECHNIQUE POUR L’ETUDE DES AMIBES

3° Laver à l’alcool à 90° ;

/i° Plonger dans l’alcool absolu additionné de quelques gouttes d’ammoniaque pendant environ i minute ; le frottis prend une teinte rose ;

50 Plonger dans l’essence de girofle. Le frottis redevient bleu. Si la couleur bleue est trop intense, on revient à l’alcool alcalin ;

6° Xylol et baume.

Tous les liquides sont mis dans des tubes de Borrel et disposés dans l’ordre convenable.

Par cette méthode on constate que dans le noyau des protozoaires la chromatine se teinte en bleu et le nucléole en rose.

d). Coloration par la méthode de Romanowsky et les méthodes dérivées. — Certains auteurs recommandent de faire des frottis de selles, de les sécher, et, après fixation à l’alcool absolu, de les colorer par la méthode de Romanowsky ou par une des méthodes dérivées, par exemple par le Giemsa, le bleu azur-éosine, le Lavera n.

On obtient ainsi des préparations qui, par la richesse du coloris, flattent l’œil, mais ne conviennent pas pour une élude cytologique des parasites. Le proloplasma des amibes est coloré en bleu, le noyau tranche nettement par sa couleur rouge, mais il est empâté, diffus et il est impossible d’en définir la structure. Si le procédé de fixation h sec et de coloration par le Romanowsky convient parfaitement pour l’étude des protozoaires du sang (hématozoaires, trypanosomes, etc.), on doit le rejeter absolument pour celle des amibes.