Étude des cellules fraîches, soit lég^èrement fixées
Flemming a fait remarquer avec raison que certains liquides dits indifférents ne sont pas cependant sans action sur les cellules et les noyaux; tels sont le sérum iodé, l'eau salée, le sérum sanguin, l'humeur aqueuse, la lymphe, etc., qu'il faut considérer comme des agents fixateurs faibles. Entre ces fixateurs très faibles, et les réactifs énergiques tels que le mélange de Flemming ou les solutions concentrées de sublimé, viennent se placer des fixateurs doux comme l'acide picrique ou l'acide acétique dilué. Ce sont ces agents doux dont il convient de faire usage pour l'étude des cellules fraîches et isolées.
Voici un exemple de ce genre de travail. On dissocie avec des aiguilles un lambeau de tissu vivant dans une goutte de solution forte de vert de mcthyle additionnée d'environ 0,75 p. 100 d'acide acétique. Les cellules sont tuées instantanément dans ce liquide, sans subir de changement de forme. On achève la fixation en exposant la préparation pendant un quart d'heure aux vapeurs d'acide osmique, on
MÉTHODES CYTOLOGIQUES 335
ajoute une goutte de solution de Rîpart et Petit, et Ton couvre d'une lamelle mince. Un autre procédé consiste à fixer d'abord par les vapeurs d'acide osmique, pendant trente secondes à deux minutes, puis à ajouter une goutte de vert de méthyle, et après cinq minutes laver à Tacide acétique à 1 p. 100 et monter dans une goutte de solution de Ripart et Petit.
Ou bien on peut fixer les cellules en dissociant le tissu vivant dans de la solution de Ripart et Petit, qu'on peut additionner au besoin d'une trace d'acide osmique, et colorer ensuite par le vert de méthyle.
L'élaboration de ces méthodes importantes est due en grande partie à Carnoy.
Pour Tétudede beaucoup de cellules, surtout des éléments du testicule, on peut employer avec succès la méthode de Pictet [Milth. aus d.ZooL Station zu NeapeL, Bd X, Ht. i, 1894, p. 92). Les éléments sont dissociés dans une solution de chlorure de manganèse de 1 àlOp.lOO additionnée de violet dahlia. La concentration du liquide doit varier avec la nature des éléments, et Ton doit déterminer le degré de concentration au moyen de quelques tâtonnements, soit en ajoutant de l'eau à la solution, soit en la renforçant avec une solution plus forte de chlorure de manganèse.
A consulter aussi lamélhodede Flemming (v4rc/i. /*. miL Anal, y XX, 188i, p. 3) pour l'élude de la division des œufs d'Echinodermes. Flemmingse servait pour fixer et colorer en même temps du carmin acétique de Schneider, ou bien il colorait d'abord par une goutte de safraaine, et fixait les cellules ensuite par Tacide acétique, qui servait en même temps à différencier la couleur. On trouvera certainement que pour la majorité des objets les méthodes de Carnoy valent mieux.
Il va sans dire qu'on peut varier les méthodes que nous avons décrites par l'emploi d'autres fixateurs et d'autres colorants. Le brun Bismarck est un colorant fort commode pour ce genre d'observations. On peut le dissoudre dans de la glycérine diluée.
606. Quelques réactions microchimiques. -- Le vert de méthyle est un réactif pour la nucléine (soit chromatine) à l'état frais tout comme l'iode est un réactif pour l'amidon. Il ne colore, au sein du noyau^ que la chromatine seule ; il ne colore ni les nucléoles, ni le caryoplasma (ou suc nucléaire des auteurs), ni la membrane. C'est pour cela que nous lui attribuons le caractère de réactif spécifique de la nucléine, caractère qu'il ne convient pas d'attribuer aux carmins, à l'hématoxyline, à la safranine, etc., ces réactifs colorant selon les cas d'une manière plus ou moins intense les nucléoles, le
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ces deux réactifs aux alcalis dilués. Il les emploie en solution de 40 à 50 p. 100. Si Ton désire enlever toute la nucléine, il est nécessaire de prolonger l'action des dissolvants, surtout lorsqu'on opère sous le verre à couvrir, ce qui est toujours à conseiller pour éviter la déformation des noyaux. Il faut souvent jusqu'à deux ou trois jours pour enlever jusqu'aux dernières traces de nucléine. Il faut se rappeler (toc. cit., p. 210) que ces expériences doivent être faites sur des cellules fraîches^ car à la suite du durcissement opéré par les agents ûxateurs la nucléine parait subir des modifications assez profondes; elle devient pour ainsi dire insoluble dans l'ammoniaque, la potasse, le phosphate de soude, etc. ; seul, l'acide chlorhydrique la gonfle et la dissout encore, quoique difficilement.
La nucléine présente vis à- vis de Tiode, de l'acide nitrique (au moins à chaud) et du réactif de Millon , les réactions des matières protéiques.
Nous venons de parler des dissolvants de la nucléine comme fournissant une preuve de la vraie nature chimique des substances que Ton peut soupçonner être de la nucléine. Ces dissolvants ont une autre qualité précieuse. En enlevant totalement toute la nucléine d'un noyau, on arrive à pouvoir étudier à Taise la structure réticulée du caryoplasma, élément qui dans la plupart des noyaux se trouve caché par l'abondance de l'élément nucléinien. Dans ce but, il convient de faire agir les réactifs avec une grande lenteur.
La digestion partielle peut rendre des services pour l'étude de l'élément nucléinien. Nous avons dit que la nucléine in situ dans les noyaux se laisse digérer en partie, à l'état frais. Mais elle résiste beaucoup plus longtemps que les albumines à l'action du liquide digestif ; une digestion modérée sert donc à mettre à nu l'élément nucléinien en le débarrassant des granulations caryoplasmiques qui en obscurcissent les contours, et sert de la même manière à éclaircir le corps cellulaire.
Dans les ligues qu*oa vient de lire le terme < nucléine » a été employé comme synonyme de ce qu'on nomme aujourd'hui plus volontiers < chromatine ». Il me semble que le terme < chromatine » est plus précis et préférable. En effet, on admet maintenant (Halliburton, Goulstonian Lectures on the Chemical Physiology of the Animal CelL, 1893, p. 574, surtout du compte rendu du British Médical Journ., n» 1681 , 18th March, 1893) qu'il existe non une seule nucléine, ma.is toute une série de c nucléines » différant entre elles surtout sous le rapport de leur richesse respective en phosphore et en substances protéiques. Elles forment une chaîne, dont le chaînon le plus élevé est représenté par lacide nucléique, contenant de 9 à U p. 100 de phosphore et point de substance protéique (ce composé se trouve, dans
la nature, dans les tôles des zoospermes). Ensuite viennent les corps habituellement dénommés < nucléines », consistant eu des substances proie iqu es avec des proportions variables d'acide nucléique. A Textrémité inrerieure de la chaîne se trouvent les nucléines qui consistent presque entièrement de substances protéiques, avec seulement 0,5 à 1 p. 100 de phosphore. Ce sont les corps qu'on a appelés les « nucléo-albumines » ; on pourrait également les appeler les < plastines artificielles ».
Tous ces corps ont été isolés des tissus les plus variés de l'organisme animal, et ont aussi été préparés artificiellement. Une série parallèle de nucléines existe dans le noyau lui-même. Il y a les nucléines les plus riches en acide nucléique; celles-ci sont très solubles dans les alcalis, et dirficiles à précipiter par les acides ; la chromaline en est une. Il y a les nucléines moins facilement solubles dans les alcalis et moins riches en acide nucléique; ce sont les plastines ; la pyrénine des nucléoles plasmatiques en est une. Et il y a des nucléines encore plus pauvres en acide nucléique ; ce sont les nucléo-albumines (qui existent également dans le cytoplasme ; — la paralin i ne, ou suc nucléaire parait consister en partie de ces corps, en partie de composés entièrement privés de phosphore). Il parait douteux si la chromaline est ou n'est pas de l'acide nucléique pur. Voici, d'après Halliburton, les réactions par lesquelles elle ressemble à l'acide nucléique : t l** elle ne donne pas la réaction de Millon, ni les réactions xantho -protéiques; 2<> elle e.^t facilement soluble dans les alcalis, difficilement dans les ctcides; 3^ elle est soluble dans le ferrocyanure de potassium dissous dans l'acide acétique; 4^ après traitement pendant vingt-quatre heures par une solution concentrée de î^ulfate de cuivre elle perd son affinité pour les matières colorantes ; mais elle ne s'y dissout pas comme l'avait prétendu Schwarz; o<* elle a une grande ailiiiité pour les couleurs de la houille, surtout pour les couleurs basiques comme le vert de méthyle. En présence d'un mélange de vert de mélhyle cL de fuchsine acide, l'acide nucléique se colore en vert. Dans ce même mélange, les nucléines un peu moins riches en phosphore se colorent en un violet bleu, tandis que celles qui sont les plus pauvres en phosphore se colorent en rouge. Or, dans les noyaux qui se trouvent en cinèse, moment où il s'y trouve un maximum de chromatine, la chromatine se colore dans ce mélange en vert; tandis que dans les noyaux au repos, alors qu'il s'y trouve une plus grande proportion de pyrénine, la coloration est bleue. »
Il résulterait de ces considérations que les nucléines, et par conséquent la chromatine des noyaux, seraient des corps basophiles ; et que les albumines, et par conséquent le cytoplasme en général, seraient acidophiles. Xoyei ce que nous avons dit à ce sujet au numéro 160. Eu tout cas, les considérations ci-dessus paraissent justifier l'emploi du mot « chromatine » pour l'élément du noyau qui se colore dans le vert de méthyle; le mot < rmcléine > ayant obtenu une signification plus étendue.
\ consulter aussi sur ce sujet Kossel, dans Das Mikro&kop de Beiirens, Ko-sEL und ScHiEFFERDECKER, II, p. 47, et daus Vcrh, d. physioL Ges. liefiiïi, 21 oct. 1892 ; Malfatti, Ber. d. nalurw. med, Verevis in Innsùruck, 1891-2 ; Zaciiarlvs, Ber. d, deutschen botan. Ges., X, 1893, p. 188; Zeit. f. wiss. Mik. , X, 1, 1893, p. 80; Lilienfeld, Verh. d. phijs. Ces, Berlin, 1892-3, numéro ii \ Zeit. /*. wiss. Mik.,\, 1, 1893, p. so ; Zacharl\s, Ber.d. deulsch. bol. Ges.y XI, 1893, p. 293 ; Zeil. f. wiss. MiL, X, 3, 1893, p. 373.
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Pour les réactions microchimiques du phosphore dans les éléments des tissus voyez Lilienfeld und Monti, dans Zeil. f. phys, Chemie, XVII, 1892, p. 410 (Zeit. f. tviss. 3/tA., IX, 3, 1893, p. 332) ; aussi dans le travail précité de Halliburton, p. 505.
606. Fixations cytolog^iques. — Flemming, qui a fait une étude approfondie de Taclioa des divers agents fixateurs sur les différents éléments cellulaires, a publié le résultai de ses recherches dans dilTérents mémoires parus dans VArch. f. mik. Anat. (1879, 1880, 1881), et dans son ouvrage Ze/feuôs^anz, Kern undZelltheilung^ 1882. Nous lui empruntons en grande partie les faits que nous allons exposer.
Les acides acétique, formique, chlorliydrique et nitrique en solution très faible (1 p. 100 ou moins) sont de bons agents fixateurs des cellules. En suivant leur action sous le microscope, on voit apparaître dans le protoplasma cellulaire et dans le noyau des détails très délicats, mais qui ne tardent pas à disparaître si Taction du réactif se prolonge. Si Ton n'arrête à temps l'action du réactif, il devient très difficile d'obtenir de bonnes préparations permanentes, parce que la fixation n*a pas été suffisante et que la cellule se laisse gonfier ou ratatiner par les réactifs auxquels on la soumet ultérieurement. Lorsqu'on se contente de faire des préparations extemporanées, et lorsqu'on se propose de déceler la présence de noyaux, soit dans un organisme inférieur soit dans des éléments cellulaires, une solution faible d'acide acétique colorée par le vert de méthyle rendra, comme nous l'avons dit plus d'une fois, les plus grands services ; son action est presque instantanée, les noyaux sont colorés en même temps que fixés.
L'acide osmique en solution de 0,1 à 2 p. 100 fixe bien la forme de la cellule entière, mais il gonfie les noyaux et ratatine les nucléoles; quelquefois il rend de plus le c réliculum > nucléaire invisible, et empêche une bonne coloration ultérieure des éléments. Ce réactif est cependant précieux lorsqu'on veut fixer des éléments doués de mouvement, comme les cellules amiboïdes, parce qu'il les tue instantanément avec la forme qu'ils possèdent au moment où on le fait agir.
Les solutions d'acide chromique de 0,1 à 0,5 p. 100 fixent bien les noyaux ; des solutions plus fortes les ratatinent, mais il est à remarquer qu'avec la même solution et les mêmes objets on n'obtient pas toujours un résultat identique, ce qui ne peut s'expliquer, d'après Flemming, que par un état physiologique difi'érent des tissus. L'acide chromique, comme Tacide osmique, ne permet pas d'obtenir une bonne coloration, et nous avons remarqué qu'il altérait souvent les
ûgures karyokînétiques. Cependant Tacide chromique donne de bons résultats pour les cellules des Vertébrés, lorsque son action n'est pas prolongée.
Les sels de chrome, bichromate de potasse ou d'ammoniaque, font nettement apparaître un réseau dans le protoplasma cellulaire et dans le noyau ; mais ces sels altérant considérablement les ûgures karyokinétiques au point de les rendre le plus souvent méconnaissables, on ne peut avoir grande confiance dans les résultats qu'ils donnent dans l'étude de la structure intime des cellules. Klein, [Quart. Jouim. of mie. Se, 1878-79) et Eimer {Arch. /*. mik. Anat., 1871, 72, 75, 77) qui ont employé dans leurs recherches le chromate neutre d'ammoniaque, et le bichromate d'ammoniaque, ont décrit une structure compliquée de certaines cellules qui demanderait à être contrôlée à l'aide de réactifs plus fidèles. Nous nous rangeons entièrement à l'opinion de Flemming qui dit que c ceux qui cherchent à étudier la division cellulaire au moyen du bichromate de potasse et des autres sels de chrome font entièrement fausse route ».
Le bichromate d'ammoniaque peut cependant donner de bons résultats dans certains cas ; c'est ainsi que Ranvier {Comptas rend, de VAc. des Se, 1879) a pu établir les connexions qui relient entre elles les cellules du corps muqueux de Malpighi sur des pièces durcies par ce sel de chrome.
L'acide picrique, en solution concentrée ou diluée, est un bon agent de fixation ; il gonfle quelquefois légèrement le noyau, mais il conserve bien les figures karyokinétiques. Il vaut mieux employer des solutions fortes que des solutions faibles. Les sels picriques (de potasse, de soude ou de baryte) ne valent rien pour les études cytologiques.
L'alcool exerce sur les cellules à peu près la même action que l'acide chromique, mais il ratatine plus souvent les noyaux.
La solution d'acide nitrique d'Altmann, le liquide de Perenyi, le liquide de Kleinenberg, sont d'excellents fixateurs lorsqu'on veut simplement constater la présence de la cytodiérèse dans les tissus, mais ils conviennent moins bien pour l'étude spéciale de la division des noyaux.
Le meilleur agent pour fixer, en général, les cellules, soit à l'état de repos, soit en voie de division, est, d'après Flemming, le mélange chromo-acéto-osmique. Si, dans ce liquide, on ne met pas d'acide chromique, on n'obtient pas de bons résultats. Si l'on supprime l'acide acétique (comme dans la formule de Max Flesch), les figures nucléaires apparaissent bien moins nettement. La présence de l'acide
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MÉTHODES CYTOLOGIQUES 361
acétique ou de Tacide formique dans les solutions osmiques favorise la précision de la coloration ultérieure par le picro-carmin, Thématoxyline et le violet de gentiane. Mais les mélanges d'acide osmique et diacide acétique sans acide chromique (Eimer) ne donnent pas d'aussi bons résultats que le mélange chromo-acéto-osmique. Les mélanges d'acide picrique et d'acide osmique, ou d'acides picrique, osmique et acétique (acide picrique, 0,5 p. 100 ; acide osmique, 0,1 p. 100, acide acétique, 0,1 p. 100) fixent presque aussi bien que les mélanges chromiques, mais la coloration subséquente est encore plus difficile à obtenir qu'après le traitement par un mélange acéto-osmique. Flemming conclut de ses recherches que l'action favorable de l'acide osmique dans tous ces mélanges doit être attribuée à la rapidité avec laquelle il tue les éléments, les autres acides ayant pour fonction de rendre nettement visible la structure de ces éléments.
Les mélanges contenant de l'acide osmique doivent être employés toutes les fois qu'on désire fixer les figures chromatiques le plus fidèlement possible ; l'acide chromique pur s'emploiera quand il s'agira d'obtenir une coloration bien nette.
Pour l'étude des figures achromatiques, Flemming recommande le mélange chromo-acétique n^ 4o. Pour l'étude des corpuscules polaires, il recommande les mélanges osmiques, ou l'acide chromique pur, avec coloration par le violet de gentiane.
Nous admettons avec Flemming et avec la majorité des cytologistes que les mélanges chromo-acéto-osmiques sont en général les meilleurs de tous les agents fixateurs des cellules. Mais le lecteur sait qu'il y a plusieurs mélanges chromo-acéto-osmiques (sans compter le mélange de Hermann). — Flemming lui-même en a indiqué deux, le mélange faible et le mélange fort. Le mélange fort avait été indiqué par Flemming en premier lieu à titre de réactif servant à différencier la chromatine cinétique de la chromatine au repos, et non comme réactif normal pour les travaux ordinaires. Laquelle de ces deux solutions doit être préférée pour les recherches cytologiques en général ? Je n'hésite pas à dire que, d'après mon expérience, c'est le mélange fort, et c'est bien là aussi Texpérience de la majorité des travailleurs.
A côté du mélange de Flemming vient le mélange de IIermann, n° 71 . L'opinion que j'ai exprimée dans ce paragraphe n'est pas sans être partagée par plus d'un naturaliste. Voyez aussi Jà-dessus l'opinion de Flemming [Arch, f, mik, Anat., XXXVII, 1891, p. 685), qui trouve que ce réactif donne une démonstration particulièrement nette des éléments achromatiques, mais que les mélanges chromo-acéto-osmi-
ques conservent mieux les éléments chromatiques. 11 me paraît certain que le mélange de Hermann durcit moins que celui de Flemming, ce qui sera un avantage ou non selon les cas (les pièces sont moins cassantes et se coupent mieux). En somme, il y a entre ces deux liquides de légères différences dont on pourra à l'occasion faire son prolil.
Pour Tétude des éléments achromatiques il me semble qu*il y a souvent avantage à diminuer la proportion d'acide organique dans l'un et l'autre de ces liquides, surtout dans celui de Hermann. Pour celui-ci on peut certainement la diminuer de moitié sans inconvénient.
Acide chromo- formique de ^Rabl, n^ 46. Chlorure platinique de Habl, no 70.
Le Liquide de Perenyi donne quelquefois d'excellents résultats.
Dans ces derniers temps, M. Heidenuain [Kern und Protoplasma, 189i!, p. 113) s'est élevé contre l'emploi trop exclusif du mélange de Flcmming, et a préconisé l'emploi du sublimé corrosif (solution saturée à froid dans une solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,5 p. 100). Cette solution aurait surtout l'avantage de pénétrer mieux que le liquide de Flemming. D'après mon expérience, cela est exact ; et il est exaot aussi que le sublimé (je parle des solutions acides) donne souvent une fixation sensiblement aussi bonne sous le rapport de la conservation des formes. Mais il faut se rappeler qu'avec du matériel ainsi préparé on ne peut pas obtenir avec la safranine, le violet de gentiane, etc., les délicates différenciations que donnent ces couleurs après fixation par le mélange de Flemming.
Il va sans dire que d'autres fixateurs que ceux-ci trouvent bien leur emploi dans certains cas. Ainsi pour les œufs de VAscaris, Talcool acétique de Carnoy, ou son mélange au chloroforme, etc.
607. Colorants de la chromatine. — Nous avons déjà parlé, numéro 604, de la coloration de la chromatine à l'état frais ou légèrement fixée. Nous avons ici à mentionner les colorants appropriés p*)ur les pièces dûment fixées par les liquides recommandés dans le nuim^ro précédent.
Nous avons, pour les pièces fixées aux mélanges chromiques, la mfranine, le violet de gentiane ou le bleu Victoria, le hémalun, el d'autres encore. Ces couleurs donnant de bons résultats, il parait inutile d'en augmenter la liste. Au point de vue de la précision de la coloration, le carmalun est à citer ici. Pour le matériel fixé au îiubliiné, etc., c'est certainement un excellent réactif. Mais pour le
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matériel chromique je dois dire que je le trouve trop peu énergique. Le ve)H de méthyle n'est pas très recommandable pour les pièces destinées à être montées au baume, parce qu'il n'a pas une puissance de résistance sufBsante à Talcool de déshydratation. Il n'en possède pas davantage dans la combinaison Ehrlich-Biondi, combinaison qui, dans mon opinion, ne devrait être employée que dans certains cas très spéciaux.
La Thionine a été recommandée (par M. Heidenuain) comme donnant des colorations supérieures à celles de la safranine. L'auteur n'explique pas en quoi consiste celte supériorité. Et comme la thionine se trouve difficilement dans le commerce, il paraît inutile de s'en occuper.
608. Colorants plasmatiques. — Il n'en existe pas un seul de vraiment bon. Tous sont d'une éleclivité imparfaite, en ce que leur action ne se laisse pas limiter avec la précision et la certitude désirable à l'élément qu'on veut mettre en relief. Presque tous, par exemple, colorent l'enchylème plasmatique en même temps que le réticulum plastinien. El, d'un autre côté, il y a des éléments importants de la cellule qui échappent en grande partie à l'action des colorants. Nous arrivons à colorer les fuseaux, il est vrai, mais à peine ; il a été impossible jusqu'ici de donner à ces éléments une coloration vraiment vigoureuse.
Le moins mauvais des colorants plasmatiques que je connaisse est le Kemschwarz. Voyez numéro 155.
Je crois qu'après le Kemschwarz le procédé qui m'a donné les meilleures images d'éléments plasmatiques est celui de Rawitz, numéro 171 ter. Puis le Procédé à V orange de FlemminÇy numéro 240. Je le recommanderais surtout dans la modification élaborée par Reinke.
Le procédé safranine- Lichtgr un de Benda, numéro 245, donne souvent de beaux résultats. Mais il est évident qu'avec un procédé dans lequel la diflerenciation et la deuxième coloration ne durent ensemble que quelques secondes, les résultats doivent être assez aléatoires.
Quelques auteurs (M. Heidenhain, et d'autres) louent beaucoup la fuchsine acide (n^ 189). Je lui reproche de donner des images plates, manquant de relief. Je lui préférerais souvent Vorange G.
Le mélange Eiirucu-Biondi-Heindenuain a été discuté aux numéros 251 et 232.
La méthode au permanganate de Henneguy a été donnée au numéro 171.
Les deux méthodes à l'hématoxyline de Benda, numéros 146 bis et 146 ^57% peuvent rendre des services.
La méthode à Valun de fer de M. Heidendain, numéro 145, est très recommandable.
La méthode à Vacide osmique et au pyrogallol a été discutée au numéro 226. C'est uue méthode de deuxième ordre et non de premier ordre.
Le carmin ferrique de Zacuarias, numéro 110 his^ m'a donné des résultats excellents sous quelques rapports : mais la coloration est toujours un peu faible.
Pour le » Nebenkern » des spermatocytes, je recommande Vhéma' toxyline à Valmi de fer de M. IlEmENHAiN, la safranine-Lichigrûn de Benda, et le procédé acide osmique et pyrogallol: Tous ces réactifs colorent ce corps d'une façon intense. Je recommande aussi le Kernschwarz qui donne des images excellentes, mais plus pâles ; ou le procédé Rawilz. Pour les vestiges de fuseaux en régression, soit corps de Platner et « Zellkoppel » de Zimmermann (des spermalocytes des Pulmonés) je recommande toujours le Kernschwarz {La Cellule, XI, 1, 1893, p. 31), ou bien le procédé de Rawitz.
Voici le procédé recommandé par Hermann {Arch. f, mik. Anal,, XXXVII, 4, 1891, p. 583) pour l'étude de V « Archoplasma » des spermalocytes de Proteus. — » Les pièces sont colorées en masse à l'obscurité durant douze à treize heures dans une teinture composée de : hématoxyline, 1 ; alcool absolu, 70 ; eau, 30. Elles sont traitées durant un temps pareil par des alcools successifs, à l'obscurité, puis enrobées et coupées et les coupes sont collées sur porte-objets.
On les traite maintenant par une solution très faible (rose clair) de permanganate de potasse, jusqu'à ce que leur couleur passe du noir opaque à une teinte d'ocre. La marche de cette diiTérenciation doit être contrôlée au microscope. On rince à leau et l'on traite par le liquide de Pal (acide oxalique, 1 ; sulfite de potassium (K*SO'), 1 ; eau, 200) allongé de 5 à 10 volumes d'eau, jusqu'à disparition de la couleur brune. Enfin on colore pendant trois à cinq minutes, pas plus, dans la safranine. Les préparations doivent montrer seuls les c granules de l'archoplasma » colorés par l'hématoxyline, le reste du protoplasma incolore, la chromatine rouge.
Noyau vitellin (cellule embryog^ène). Méthode de Balbiani. [Zool. Anzeiger, VI, 1883, p. 659). — La vésicule embryogéne se voit à l'état frais sans aucun réactif dans l'œuf de certains animaux, entre autres un grand nombre d'Arachnides et de Myriapodes. Pour
MÉTHODES CYTOLOGIQUES 365
la faire apparaître plus nettement, on fait agir directement sur Tœuf, sous le champ du microscope, un mélange à parties égales d'acide acétique et d'acide osmique à 1 p. 100, auquel on ajoute une petite quantité de sel marin. Ce mélange rend les œufs moins granuleux queTacide acétique dilué employé seul.
Pour les coupes, méthode au permanganate de Henneguy.
609. Granules ou « Bioblastes > d'ÀLTMANN. Pour la démonstration de ces objets, dont lanature parait être assez problématique, voyez Altmann, Studien ûber die Zelle, 1886 ; Die Elementarorganismen, Leipzig, 1890 ; et un mémoire dans Arch. /*. Anal. w. Enlwick., 1892, p. 223 ; aussi Zeit. f. wis8, MiLy VII, 2, 1890, p. 199, et IX, 3, 1893, p. 331 ; puis L. et R. ZOJA, Mem. R, Isl. Lombardo.XW, 3, VII, p. 237; Fischer, Anal. Anz,, IX, 4894, numéro 22, page 678 (il pense que ces granules sont en partie du moins des précipités de peplone produits par les réactifs fixateurs).
610. Autres méthodes oytologlques générales. — Strasdurger (Arch,^,mik,AnaL,XXl, 1881, p. 477). - Uskoff (iircA. /l mtA\i4na/., XXI, 1882, p. 292). — Pfitzner [Morphol. Jahrb.^ XI, 1885, p. 54). — TizzoNi, {Bull, délie Se. Med. di Bologna, 188'*, p. :i59). — Baumgarten \zeiL f. tciss. Mxk.,\, 1884, p. 415). — BizzozERO (iôirf., III, 1886, p. 24). — Babes [ibid., IV, 4, 1887, p. 470). — Zwaardemaker (ibid., IV, 2, 1887, p. 212). — Njssen {Arch. f. mik. Anal., 1886, p. 338). — Schottl.ender (Arch. f. mik. Anal., XXXI, 1888, p. 426 ; Zeit. f. wiss. Mik., V, 4, 1888, p. 515).
611. Cytologie de Tœuf. (a. Ascaris). — Van Beneden {Arch. de Biol.y IV, 1883, p. 279). — Carnoy (La Cellule, II, 1, 1886, p. 17, 18; III, 1, 1886, p. 6 ; III, 2, 1887). — Van Beneden et Neyt (Nouv. Rech. sur la Fée, etc., à part, 1887, ou Bull. Acad. roy. d. Se. de Bruxelles, 1887, III sér., XIV ; Jaurn. Boy. Mie. Soc, 1888, p. 508). — Boveri (Zellen-Studien dans Jen. Zeit. f. Nalurw., XXI, 1887, p. 423, ou à part; Joum. Boy. Mie. Soc, 1888, p. 664). •— Zacharias (Anat. Anz., III, 1888, p. 24; Joum. Roy. Mie Soc, 1888, p. 663). — Van Gehuchten (ibid., p. 237). — Kultschitzky {Arch. f. mik. Anat., XXXI, 1888, p. 567). On trouvera un résumé de la partie technique de tous ces mémoires dans Zeit. f. wiss. Mik., V, 3, 1888, p. 367. IlERLA {Arch. de BioL, 13, 3, 1893 [4], p. 423).
(b. Autres œufs) Hertwig, 0. {Morph. Jahrb., X, 188'*, p. 338, Bana). — IIertvvig, 0. und R. {Jen. leit. f. Nalurw., XÏX, 1883, p. 124).— Fécondalion de 5/ron^y/ocen/ro/M« (Echinodermata). — Aussi : z«^ f' wiss. Mik., III, 4, 1886, p. 505, et Joum. Roy. Mie. Soc, 1887, p, 835. — Boveri (Zellen-Sludie^i, III [Echinodermala], ia Jen. Zeit. f. Nalurw., XXIV, 1890, p. 314, ou à part.)
612. Spermatogenèse. — Garnoy {La Cellule, I, 1885, p. 209, Arthropodes). — Gilson {Ibid., I, 1885, p. 40, 56, 38, 87, 121, 141, et II, 1886).
PiCTET {Mitth. a. d. Zool. Stat. Neapel, X, 1, 1891, p. 89) cite comme liquide additionnel pour les cellules fraîches la solution à
5 OU 10 p. 100 de chlorure de manganèse additionnée d'une faible quantité de dahlia. Je Tai essayé et m'en suis bien trouvé.
Ces travaux donnent des renseignements utiles sur les procédés de dissociation, etc., pour Tétude de cellules fraîches. Pour les détails des méthodes de coupes qui ont été employées, voir les nombreux mémoires cités dans les rapports de Hermann, dans Ergebnisse dei" Anat,, i, (1891) 1892, p. 200, et II (1892), 1893, p. 201. A. citer parmi ceux-ci : Benda, Verh. d, anal. Ges.^ VII Vers., Gotlingen, 1893, p. 161 ; Zeit. /*. wiss. Mik,, XI, 1, 1894, p. 69. (Nous avons donne au numéro 146 bis la méthode de coloration recommandée.)
ORGANES TÉGUMENTAIRES
613. Tissu épithélial. — Pour des vues de surface des épithéliums tégiimentaires, il est souvent d'une grande utilité, ou même (|uelquefois nécessaire, d*employer des imprégnations au nitrate d'argent. Nous renvoyons pour ce qui concerne ces manipulations à notre chapitre des < Imprégnations ». Le lecteur pourra également consulter avec iruit les excellentes instructions données par Ranvikr {Traité technique, p. 246 et suiv.), de même que le mémoire de TouR- NEUx et Hermann [Joum. de VAnat., 1876, p. 200).
Les coupes se font très facilement d'après les méthodes communes. Le meilleur réactif durcissant pour la peau parait être la solution de Millier. C'était déjà la conclusion de F.-E. Sciiultze en 1867 {Arch, /*. mik. Anat., p. 145), et c'est celle de Tizzoni qui a fait les recherches les plus importantes sur cet organe {Bull, délie Set. med. di Bologna, 1884, p. 259). D'après des observations récentes, le formol pourrait bien se montrer utile ici.
Pour les épithéliums^/andM^rtires, il est souvent préférable d'employer un liquide chromique, ou l'acide osmique (voyez par exemple Ranvier, toc. cit,y p. 258 et suiv.) ou bien l'alcool absolu (Blaue, Arch. f, Anat. ti. Phys,, 1884, p. 231) ; le liquide de Kleinenberg est moins bon.
Epithélium cilié, voyez numéro 763.
Les macérations se font : pour les épithéliums mous, avec un agent dissociant doux, tel que le sérum iodé, l'alcool au tiers, la salive, ou un mélange de salive et de solution de MUller (Schultze), ou de salive avec 3 à 4 volumes de solution de sel de cuisine à 0,75 p. 100 (BizzozERO, Intern. Monalsch, f. Anat., 1885, p. 278) ; —
M wy
pour les épithéliums durs, avec des dissociateurs énergiques, tels que la potasse à 40 p. 100.
MiNOT recommande une macération de quelques jours dans de la solution de sel de cuisine à 0,6 p. 100, additionnée de 0,1 p. 100 de thymol, procédé qui permet d'isoler Vépiderme des embryons, et rend des services dans l'étude du développement des poils [Amer. NaturaL, XX, 1886, p. 875 ; Joum. Roy. Mie, Soc, YI, 1886,
MiTROPUANOW {Zeil. f. wiss. Mik., V, 4, 1888, p. 813) donne le procédé suivant : On fixe un embryon d'Axolotl pendant un quart d'heure dans de l'acide nitrique, à 3 p. 100, et on le met dans de l'alcool au tiers. Une heure après, l'épiderme commence à se séparer par places , et si maintenant on met l'embryon dans de l'alcool plus fort, on trouvera l'épiderme presque entièrement séparé au bout de vingt-quatre heures.
Pour le même butBLASciiKO, puis Loewy {ibid., \l\l, 2,1891, p. 222) recommandent une macération de vingt-quatre heures ou plus à une température de 40» C. dans de l'acide pyroligneux à 6 p. 100. Cet auteur recommande également l'acide acétique à 0,3 p. 100 de Pni- UPPSON {ibid.).
Dentelures et canaux intercellulaires des cellules de Vépiderme. — Outre la macération qui est une méthode des plus importantes pour l'étude de ces objets, les imprégnations peuvent rendre des services. Mitrophanow [Zeit. tviss. ZooL, 1884, p. 302, elArch. f. Anal. u. Phys., 1884, p. 191) recommande le procédé suivant (pour la queue des têtards d'Axolotl) : on rince la queue à l'eau distillée; on la met pour une heure dans du chlorure d'or à 0,25 p. 100 avec une goutte d'acide chlorhydrique pour un verre de montre de la solution; on lave et on réduit dans un mélange de 1 partie d'acide formique avec 6 parties d'eau.
A consulter surtout sur ce sujet les importants mémoires d'iDK {La Cellule, IV, 2, 1888, p. 409, et V, 2, 1889, p. 321). Ide s'est servi comme colorant plasmatique d'hcmatoxyline alunée. Je pense qu'il y aurait avantage à s'adresser à l'une ou l'autre des autres laques hématoxyliques (n^* 143 à 148). Au lieu d'imprégnations métalliques, il semble indiqué de recourir plutôt à l'imprégnation au bleu de méthylène, voyez numéro 188. La méthode de Kromayer [Arch. f, mik, Anat,, XXXIX, 1892, p. 141 ; Zeit. f. iviss. Mik., IX, 1, 1892, p. 84, et IX, 3, 1893, p. 385), pour la démonstration de la « fibrillation protoplasmique des épithéliums >, n'est qu'une application du procédé de Weigert pour la coloration de la fibrine. Kromayer procède ainsi :
^ii
ORGANES TÉGUMENTAIRES 369 H
On colore des coupes pendant cinq minutes dans une solution aqueuse concentrée de violet de méthyle 6 B (ou bien de violet de gentiane ou de Krystallviolett) allongée d'un volume égal d'eau anilinée. On les lave à Teau et on les traite jusqu'à ce qu'elles soient devenues d'un noir bleu (une à trente secondes) par une solution d'iode dans Tiodure de potassium (solution de Lugol). On lave de nouveau à Téau, on sèche avec du papier buvard, et on traite jusqu'à différenciation suffisante par un mélange de 1 volume d'huile d'aniline avec 2 volumes de xylol, puis par le xylol pur, après quoi l'on monte.
Pour le même objet, fibrilles des épithéliums, Unna [Monatschr, f, prakt. DermatoL, XIX, 1894, p. 1, et p. 277 et suiv. ; ZeiL f. wiss. Mik., XII, 1, 1898, pp. 61, 63) a donné toute une série de méthodes très minutieuses, dont nous faisons les extraits suivants :
1. WaBserblau-Orcéine. — Colorer des coupes pendant dix minutes dans une solution aqueuse neutre à 1 p. 100 de Wasserblau (bleu alcali), rincera l'eau et colorer pendant cinq à dix minutes dans une solution alcoolique neutre à 1 p. 100 d'orcéine de Griibler. Déshydratation, essence, baume. Puis les variantes suivantes :
a. Dix minutes dans le Wasserblau, et trente minutes ou plus dans l'orcéine ;
b. Prendre pour la deuxième coloration une solution acide d'orcéine ;
c. Colorer seulement une minute dans le Wasserblau, mais trente ou plus dans l'orcéine neutre.
2. Colorer pendant une demi-heure ou plus dans une forte solution de hémalun, rincer, colorer une demi-minute dans une solution aqueuse saturée d'acide picrique, déshydrater (trente secondes) dans de l'alcool contenant 0,8 p. 100 d'acide picrique.
3. Hémalun comme ci-dessus (deux heures), orcéine neutre comme ci-dessus, dix à vingt minutes.
Outre ces méthodes, Unna en donne une demi-douzaine d'autres qu'il serait inutile de présenter au lecteur détachées de la partie théorique du travail d'UNNA.
614. Poils, ongles. — Pour la dissociation, la solution de potasse à 40 p. 100 (il faut laisser macérer pendant un temps prolongé) ; ou bien faire chauffer avec l'acide sulfurique concentré. Voyez aussi V. Natuusius, Zool. Anz,y XV, 1892, p. 393.
Les tissus cornéCés se laissent bien colorer par la safranine ou le
AXAT. UICROSC. 2i
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violet de gentiane. (Reinke, Arch. f, mik. Anat,, XXX, 1887, p. 183; Zeit. /•. 7mss, Mik., IV, 1887, p. 383.)
615. Nerfs iutra-épidermiques. — Ils doivent être étudiés par la méthode de Tor; voyez Ranvier {Traité,^, 900). Ranvier recommande l'emploi du mélange d*acide formique et de chlorure d'or dont nous avons parlé au n^ 252. On fait bouillir ensemble 4 parties de solution de chlorure d'or à 1 p. 100, et 1 partie d'acide formique ; on laisse refroidir le mélange. On prend de petits morceaux de peau, on les met pendant une heure environ dans ce mélange, et Ton effectue la réduction à la lumière du jour dans de l'eau légèrement acidulée par l'acide acétique. La réduction obtenue, on met les fragments dans l'alcool qui achève de les durcir, et qui a l'avantage d'arrêter la réduction ultérieure de l'or, ce qui fait que les préparations ne noircissent pas par la suite. On fait des coupes par les méthodes connues.
WOLTERS [Zeit, f, wiss, Mik., 1893, p. 360) se sert de la coloration cylindraxile à l'hématoxyline que nous donnerons au chapitre xxix.
616. Ménisques tactiles du gi*oin de Porc (Ranvier, loc, cit., p. 910). — On les étudiera sur des coupes verticales du groin traité par la méthode du chlorure d'or avec l'acide formique que nous venons de donner, ou par la méthode du chlorure d'or avec le jus de citron dont nous donnerons le détail à propos de la cornée. On pourra également étudier par ces méthodes le groin de la Taupe, qui est un objet très commode.
617. Corpuscules tactiles (Fischer, Arch, f. mik, Anat., 1873, p. 366). — Fischer employait la méthode à l'or de Lœwit, que nous avons données au n® 220. Cette méthode est également recommandée par Ranvier. Après avoir imprégné des morceaux de peau en bloc, on les durcit par l'alcool et on fait des coupes. On emploiera aussi l'acide osmique et le picrocarmin selon les procédés connus. Nous avons trouvé que les auteurs sont d'accord pour insister sur l'importance de ces deux réactifs dans ces recherches.
618. Corpuscules tactiles (Ranvier, Traité^ p. 919). — Imprégnation par l'or, selon la méthode de l'acide formique (n** 615) ou selon la méthode du jus de citron que nous donnons à propos de la cornée. Faire des coupes et les colorer par le picrocarmin, la purpurine, l'hématoxyline, etc.
ORGANES TÉGUMENTAIRES 371
619. Corpuscules tactiles (Smirnow, Intem. Monatsschr. f. Anal,, etc., X, 1893, 6, p. 241 ; Zeit. f. wiss. Mik„ X. 2, 1893, p. 254). — L'auteur conseille le chlorure d'or de Lôwit, et la méthode rapide au chromate d*argent de Golgi.
620. Corpuscules de IIerbst et de Grandry (becs de Canards). — DoGiEL [Arch, f. AnaL u. Entw., 1891, p. 182 ; Zeii, f.wiss. Mik,, VIII, 4, 1892, p. 620) conseille le procédé au bleu de méthylène. On injecte dans les vaisseaux de la tète une solution de bleu de méthylène à 4 p. 100, chauffée à 40® C. On enlève des lambeaux de peau du bec, on les monte dans de la moelle de sureauet on pratique des coupes. On met les coupes sur une lamelle et on les humecte d'humeur vitreuse ou aqueuse, additionnée de quelques gouttes d'une solution de bleu de méthylène à 1/16 p. 100, et on les laisse exposées à Pair. Après quelques minutes les terminaisons nerveuses sont colorées, et Ton fixe par le picrate d'ammoniaque (n* 186).
Geberg \ibid,, X, 2, 1893, p. 244) a également employé cette méthode. Il a employé aussi Tacide osmique simple, et le procédé au chlorure d'or d'ÀRNSTEiN, qui est le suivant: des portions de peau sont mises pour vingt-quatre heures dans de l'eau de chaux, ce qui permet d'isoler la couche cornée. Gela fait, on coupe la peau en petits morceaux et on les met pour cinq minutes dans une solution de chlorure d*orà0,2op. 100. La réduction s'établit très rapidement, les pièces sont déjà brunes au bout de quelques minutes. On achève la réduction en les mettant pour vingt-quatre heures dans de l'eau distillée. Il se forme un précipité granuleux qu'on éloigne en mettant les pièces dans une solution de cyanure de potassium à 1/4 p. 100 et en brossant vigoureusement avec un pinceau. Alcool, essence, damar. Geberg, lui, employait le chlorure d'or à la dose de 0,5 p. 100 et le laissait agir pendant trente minutes.
Voyez aussi Carrière, Arch. f. mik. Anat., 1882, p. 146 (réduction dans le liquide de Pritchard, n^ 223).
621. Corpuscules de Meissner et de Krause de la cornée, conjonctive et paupières (Dogiel, Arch. f. mik. Anat., XXXVII, 1891, p. 602, etXLIV, 1, 1894, p. 15). — Coloration par l'humeur aqueuse additionnée de bleu de méthylène comme nous l'avons dit aux n<** 184, 186, 620. Voyez aussi les méthodes de Longwortu, Arch. f. mik. Anat., 1875, p. 655.
622. Poils tactiles (Ranvier, Traité, p. 914). — Ranvier recom-
Goog\(^
mande la méthode du chlorure d'or à Tacidc formique (n*» 615). Après avoir isolé les bulbes et en avoir incisé la capsule, on les maintient pendant une heure environ dans le mélange de chlorure d'or et d'acide formique, on réduit dans de l'eau légèrement acétiflée, on durcit à Talcool et l'on fait des coupes longitudinales et transversales.
623. Langue de la Grenouille (disques terminaux), Fajerstajn (Feuerstein), Arch. de ZooL exp. eigén.^ VII, 1889, p. 705;. Bleu de méthylène. Langue du Lapin, von Lenhossek, Zeii. f. tviss. }fik,, XI, 3, 1894, p. 377. Chromate d'argent de Golgi (imprégnation double de Ramôn y Cajal). Hématoxyline chromique de Heidenhain. Papillœ foliatœ du Lapin, Hermann, Zeit, f, wiss. Mik., V, 4, 1888, p. 524. Organes olfactifs de Vertébrés, Dogiel, ylrcA. f. mik. AnaL,\9%l^ p. 74. Organes d'un < sixième sens > chez les Amphibiens, MiTROPHANOW, Zeit, f. toiss, 3AA., V, 4, 1888, p. 813 (détails sur la coloration au « Wasserblau >, pour lesquels voyez aussi BioL Centralb.^ Yll, 1887, p. 175).
624. Cornée. — Les imprégnations à Tor et à l'argent sont indispensables pour l'étude de la cornée.
On obtient facilement des images négatives des cellules fixes de la cornée par la méthode de l'imprégnation avec le nitrate d'argent en nature (Klein). Il faut enlever Tépithélium conjonctival sur une cornée vivante, et passer à plusieurs reprises, sur la surface de la cornée mise à nu, un crayon de nitrate d'argent. Après une demi-heure environ, on peut exciser la cornée et la soumettre à l'observation dans l'eau distillée.
Pour obtenir des images positives des cellules fixes, Ranvier {Traité^ p. 863) recommande de faire macérer deux ou trois jours dans l'eau une cornée dans laquelle on a déterminé d'abord une imprégnation négative au nitrate d'argent. On obtient une imprégnation secondaire, positive, qui donne des images très nettes et élégantes.
On obtient les mêmes résultats en cautérisant une cornée avec le crayon et en la laissant en place, sur l'animal vivant, pendant deux ou trois jours, ou bien en traitant par une solution diluée de chlorure de sodium ou d'acide chlorhydrique une cornée à laquelle on a fait subir une imprégnation négative (llis).
Mais les meilleures images positives sont celles que fournit le chlorure d'or. Ranvier {Traité^ p. 864) recommande de procéder de la manière suivante. La cornée détachée est posée pendant cinq minutes dans du jus de citron fraîchement exprimé et filtré sur de la fianelle.
ORGANES TÉGUMENTAIRES 373 t
On la porte ensuite pendant un quart d*heure environ dans une solu- '
tion de chlorure double d'or et de potassium à 1 p. 100, et Ton obtient !
la réduction à la lumière du jour dans de l'eau acétifiée {"2 gouttes ^
d'acide acétique pour 80 ce, Traité^ p. 813). Il importe que le séjour de la membrane dans la solution d'or ne soit pas trop long; car, au delà d'une certaine limite qui, en général, ne dépasse pas vingt-cinq minutes, l'imprégnation porte seulement sur les nerfs, et les cellules fixes ne sont plus colorées que d'une façon incomplète.
Les nerfs de la cornée doivent être étudiés par la même méthode :
^oukiT (Stricker's Handbuch^ p. lllo) recommande une imprégnation double par Targent suivi de l'or, pour obtenir l'imprégnation négative par l'or. On traite une (tovtiée pendant très peu de temps par une solution de nitrate d'argent à 0,5 p, 100, on opère la réduction et l'on met la cornée dans une solution de chlorure d'or à 0,5 p. 100. La coloration brune de l'argent disparaît aussitôt que la cornée est placée dans la solution d'or; après quelques minutes, on expose la préparation à la lumière dans l'eau acétifiée. L'or s'y réduit rapidement; et à la place de la coloration brune de l'argent, la substance fondamentale prend la coloration violette de l'or. Les cellules fixes sont cependant toujours visibles, reconnaissables à leur aspect granuleux et à leur coloration jaune.
Renaut [Comptes rendus^ 1880, p. 137) procède ainsi : acide formique, 20 p. 100, dix minutes ; chlorure d'or, 1 p. 100, vingt-quatre heures: acide formique au tiers, vingt-quatre heures.
Voyez aussi la méthode de Ciaccio, Arch. ital, de Diol., III, p. 75, et celle de Hoyer [n? 223). Pour la très importante méthode au bleu de méthylène^ voyez numéro 188.
625, Cornée, autres méthodes (Rollett. S tricher' s Handbuch, p. 1102). — Rollett recommande particulièrement le procédé suivant : on met une cornée fraîchement extirpée dans une chambre humide où on l'expose aux vapeurs d'iode. Aussitôt qu'elle est devenue brune, on pourra enlever l'épithélium. Si la réaction n'est pas complète, on remet la cornée dans la chambre humide et l'on continue l'action de l'iode. Lorsque la préparation aura absorbé une quantité suffisante d'iode, on pourra l'examiner, et l'on trouvera alors le réseau de cellules fixes démontré avec une évidence qui ne le cède guère à celle des préparations faites par l'or. Cette méthode possède l'avantage de ne jamais manquer, ce qui n'est malheureusement pas le cas avec l'or. La méthode est également admirable sous le rapport de la bonne fixation des cellules.
Macération, — Pour la dissociation des fibres, Rollett recommande la macération dans une solution de permanganate de potasse, additionnée ou non d'alun. Aussitôt que le tissu est bruni, on l'agite dans une éprouvette avec de Teau.
Méthode de Tartuferi {Anat, Anz,^ V, 1890, p. 524 ; Zeit. /". wiss. Mik., VII, 3, 1890, p. 365, et XI, 3, 1894, p. 346).
626. Cristallin; durcissement (Lgewe, Arch. f. mik. Anat,^ 1878, p. 557). — Mettre un bulbe frais dans plusieurs litres de solution de bichromate de potasse à 1 p. 100; changer la solution fréquemment en en augmentant graduellement la concentration jusqu'à avoir une solution saturée. Après être resté dans cette solution au moins un an et demi, le bulbe aura acquis une consistance permettant de faire des coupes.
Macération. — Acide sulfurique de Max Schultze (n*^ 516).
