DURCISSEMENT

678. DorcisBement par congélation. — La méthode de la congélation est très admissible ici et peut surtout rendre des services pour Tétude bislologique de Técorce. Pour une description détaillée des manipulation

de la congélation et des coupes, nous renvoyons au traité consciencieux précité de Bevan Lewis. — Nous dirons seulement deux mots de la méthode de congélation à employer. S'il s'agit d'un organe qui a été déjà durci par les procédés connus, on pourra employer la méthode de congélation par le mélange de glace et de sel de cuisine ; mais en ce cas il faut avoir soin d'infiltrer préalablement le tissu par une masse mucilagineuse ou gélatineuse (n<** 309, 310), sous peine de voir se former dans les tissus des aiguilles de glace qui rendront impossible l'obtention de belles coupes. Mais s'il s*agit d'un organe frais, c'est la méthode de congélation par un vaporisateur à l'éther qu'il convient de prendre. Cetlc méthode, qui permet de créer rapidement et de maintenir ou de faire cesser à volonté tous les degrés d'intensité de congélation, permet de se dispenser de l'emploi de masses d'infiltration ayant pour but de prévenir la formation de cristaux de glace ; c'est la seule méthode qui permette d'obtenir des coupes un peu satisfaisantes de tissu nerveux non durci. On fait flotter les coupes sur l'eau, on les traite (Lewis) pendant une minute sur le porte-objet par l'acide osmique à 0,25 p. 100, on lave pendant cinq minutes à l'eau, et l'on colore.

679. Durcissement par les réactifs. — Avant d'exposer un organe nerveux ou une portion d'un tel organe à Faction d'un réactif durcissant, il convient de prendre les précautions nécessaires pour que les pièces ne se déforment pas. Si l'on ne soumet au durcissement que des portions relativement petites de tissu nerveux, le mode opératoire est très simple. On peut découper une moelle ou une région quelconque de Tencéphale en tranches de quelques millimètres d'épaisseur, les poser sur de la ouate, et les transporter avec la ouate dans un récipient dans lequel on verse ensuite le liquide durcissant. La ouate remplit deux fonctions : elle forme un coussin élastique sur lequel les pièces peuvent reposer sans se déformer par leur propre poids ; et elle leur permet d'être en contact avec le réactif par leurs faces inférieures aussi complètement que par leurs autres faces, ce qi^i est important au point de vue de la rapidité de pénétration du réactif et de l'égalité du durcissement obtenu. Il est bon de suspendre les pièces, toujours enveloppées de ouate, dans le récipient ; si l'on fait usage d'un récipient en forme de cylindre, et que l'on suspende les pièces vers le haut du cylindre, on activera notablement les processus de diffusion et la pénétration du réactif. En tous cas, si Ton pose des pièces à plat sur le fond du récipient, il ne faut jamais les poser les unes sur les autres.

S'agit-il de pièces volumineuses qu'on désire cependant ne pas diviser en portions, on fera autant que possible des incisions plus ou moins profondes dans les endroits les moins importants à sauvegarder ; nous recommandons de ne pas enlever les membranes, si ce n'est la dure-mère ; elles servent utilement à donner du support à la

Goog\(^

préparation. On pourra enlever en partie la pie-mère et Tarachnoïde après que le durcissement aura fait quelque progrès.

On peut durcir en totalité la moelle épinière, la moelle allongée et le pont de Varole. On enlève la dure-mère, et Ton suspend la pièce dans un vase cylindrique. On attache un petit poids à la partie inférieure de la préparation, dans le double but d*empccher qu*aucune partie de la préparation ne vienne à nager au-dessus de la surface du liquide (ce qui arrive facilement avec l'emploi de liquides un peu denses, comme le liquide de Millier), et d'empêcher les torsions des tissus qui peuvent, sans cette précaution, être produites par les fibres élastiques de la pie-mère et de Tarachnoïde.

Le cerveau doit être très délicatement posé sur une couche de ouate, ou, si cela est possible, suspendu dans une enveloppe de ouate. On mettra des tampons de ouate dans la scissure de Sylvius, et entre Toperculum et le lobe médian, et, autant que possible, entre les circonvolutions. Cette précaution est indiquée dans Tintérét de la pénétration du liquide durcissant. Autant qu'il ne s'y oppose pas de raisons majeures, on divisera préalablement le cerveau en deux moitiés symétriques par une incision sagittale passant par le plan médian du corps calleux. Betz conseille d'enlever, après quelques heures de durcissement, la pie-mère partout où elle est accessible, et également les plexus choroïdiens. Nous avons trouvé cette opération un peu délicate, et nous ne la recommandons qu'à des mains expérimentées.

Le cervelet se traite d'après les mêmes principes.

Weigert {CeniralbL f. d. nied. wiss., 188:2, p. 819 ; Zeil. f. wiss, Mik,, 1884, p. 388) a trouvé que le durcissement des centres nerveux par le liquide de Millier ou par celui d'Ërlicki est activé si l'on maintient les préparations dans un incubateur à une température de 30 à 40*^0. A cette température, le liquide de Muller peut durcir en huit à dix jours, le liquide d'Ërlicki en quatre jours, tandis qu'à la température normale il en faudrait deux ou trois fois autant.

Notons ici que Sahli, qui a étudié en détail l'action des sels chromiques, est d'avis que le procédé du durcissement à l'incubateur est beaucoup moins sûr que le durcissement lent, et devrait être abandonné. (Voyez Zeit. /". wiss, Mik.^ 1885, p. 3.) Se décide-t-on pour le durcissement lent, il est bon de tenir le matériel très au frais ; en été, on le mettra à la cave, ou mieux dans une glacière.

680. Fixation par injection. — Chez les animaux inférieurs il est possible d'introduire des liquides fixateurs et durcissants au sein des centres nerveux par injection, ce qui procure une pénétration des organes incom-

parablement plus rapide que celle qu'on obtient par la simple immersion dans les réactifs. De Quervain < Virchow's Arch,^ CXXXIII, 1893, II. 3, p. 481 ; Zeil. f. wtss.Mik,, X, 4, 1893, p. 507) a réussi avec des Chiens et des Chats. Le sujet, légèrement chloroformé, est flxé sur la table à opérations. On met à nu une carotide, ou la coupe et on fixe dans la portion centrale aussi bien que dans la portion périphérique une canule à robinet. On ouvre d'abord le robinet de la portion centrale, et on laisse s'écouler le sang jusqu'à ce qu'il n'en vienne plus. Ensuite on injecte par la canule périphérique (donc vers le cerveau) du liquide de Millier, à la température du corps, et sous une pression modérée. On injecte encore alternativement par la canule centrale et la canule périphérique une quantité de Ifquide de Miiller égale à la quantité de sang écoulé : pour des Chiens il faut de 300 à 600 ce., pour des Chats un tiers ou la moitié de cette dose. L'injection faite, on pose des ligatures, on enlève l'encéphale, et on le met pour quelques semaines dans du liquide de Miiller tenu à 37^ C.

Mann {Zeit, f, wiss, Mik.^ XI, 4, 4894, p. 482) procède d'une manière semblable. 11 pratique l'injection par l'aorte ascendante. Avant de pousser l'injection fixatrice, il injecte pendant une vingtaine de secondes de la solution physiologique de sel, chauffée à 39<^ C. Ceci a pour but de laver les capillaires du cerveau, de sorte que le sang ne puisse pas s'y coaguler. Le fixateur dont se sert Mann est une solution saturée de sublimé, chauffée à 39^ C. Au bout de cinq minutes d'injection, le cerveau doit se trouver entièrement (ixé. On le sort, et on le met pour douze heures dans de la solution de sublimé, après quoi on le conserve dans du sublimé faible, 0,1 p. 100, ou bien on passe par les alcools usuels à l'inclusion dans la paraffine.

681. Les réactifs durcissants à employer. — Les durcissants les plus importants sont les sels chromiques. Vu la lenteur avec laquelle ces sels pénètrent, il e:3t souvent recommandabie de traiter les pièces en premier lieu pendant vingt-quatre heures ou plus par l'alcool de 80® à 90*^, pour empêcher la macération des parties éloignées de la surface. On s'est beaucoup servi dans le temps d'acide chromique, mais la plupart des travailleurs sont d'accord pour admettre que son action, quoique bien plus rapide que celle des sels chromiques, est plus inégale et donne souvent lieu à une friabilité désastreuse des tissus. L'acide osmique est excellent — selon Bevan Lewis, de beaucoup le meilleur des durcissants ; — mais malheureusement son emploi est borné à des pièces très petites ; on ne saurait guère l'employer avec des objets de plus de 1 centimètre cube de volume.

La grande majorité des travailleurs sont d'accord pour admettre que c'est le bichromate de potasse qui donne en général les meilleurs résultats. Les opinions ne sont guère partagées que sur le point de savoir si ce sel doit être employé pur ou en combinaison avec d'autres sels. Nous avons déjà noté que le liquide d'ERLicKi exerce une action durcissante plus rapide que les autres solutions de sels chromiques; pour ce motif c'est un des réactifs les plus employés. Sahli cependant

[l. c. n° 679) après une étude spéciale de celte question, a conclu que le meilleur des durcissants pour du matériel frais est le bichromate pur à 3 ou 4 p. 100, agissant à une basse température. Il n'approuve pas l'addition de sulfate de soude (liquide de Millier), et rejette le liquide d'Ërlicki à cause des précipités auxquels il donne si souvent lieu. Obersteiner est du même avis.

Deux observateurs récents, Fisn {The Wilder Quarter-Century Book, 1893, p. 385), et Donaldson [Joum. of MorphoL, IX, 1894, p. 123 ; Joum, Roy. Mie, Soc, 1894, p. 64i2) ont fait de nombreuses pesées et déterminations de volume pour contrôler les changements produits dans des encéphales de Mouton par les réactifs durcissants. Ils ont trouvé que, alors que tous les autres réactifs provoquent une diminution de poids et de volume, les solutions de bichromate produisent une légère augmentation et de poids et de volume.

La formaline est un réactif qui est trop récemment a Tétude pour qu'il soit possible d'avoir une opinion définitive à son sujet. Voyez numéro 93.

Relativement à la question de savoir jusqu'à quel point certaines altérations soi-disant pathologiques des cellules glanglionnaires doivent être attribuées à la putréfaction ou à l'inQuence des réactifs, voyez le Neurologisches Centralblatt^ des années 1884 et 1885.

Pour les taches c pigmentaires > produites par le liquide d'Erlicki, voyez le numéro 57.

682. Doses des réactifs durcissants. — Il faut se souvenir que, excepté pour le cas de l'osmium, il faut toujours commencer le durcissement en employant le réactif à la dose la plus faible qui est compatible avec la bonne conservation des tissus ; on changera fréquemment le liquide durcissant et on en augmentera à mesure la concentration.

Le bichromate dépotasse s'emploie au début à une concentration, en général, de !2 p. 100 ; on passe ensuite à des solutions plus concentrées, jusqu'à 3 ou 4 p. 100 pour la moelle et pour le cerveau, et jusqu'à 5 p. 100 pour le cervelet.

Le bichromate d^ammoniaque se prend de moitié plus faible, et même encore plus dilué (jusqu'à 0,5 p. 100), du moins au début; on peut aller jusqu'à 5 p. 100 à la fin du durcissement, pour le cervelet.

Vacide chromique ne s'emploie guère plus, si ce n'est en combinaison avec un autre réactif; nous donnons plus bas les formules de quelques mélanges de ce genre. On peut ajouter aux solutions des

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sels chromiques une faible proportion diacide chromique, par exemple 3 à 6 gouttes d'une solution à 1 p. 100 pour 100 ce. de la solution de sel. Gela active un peu le durcissement et ne fait pas de mal.

L'acide osmique s*emploie à 1 p. 100; à cette dose il durcit convenablement de petits fragments de tissu nerveux en cinq à dix jours (Exner).

V acide nitrique a été employé à des doies de 10 à 12 p. 100. A cette dose il fournit des préparations ayant beaucoup de consistance; nous ne savons si la conservation histologiquc est bonne.

A. KoTLAREWSKY (Zcit. f. wiss, Mik., IV, 3, 1887, p. 387) a trouvé que Tacétate neutre de plomb à 10 p. 100 conserve très bien les cellules ganglionnaires.

Trzebinski (Virchow's Arch.y 1887, p. 1 ; Zeit. f, 'juiss. MiL, IV, 4, 1887, p. 497), puis DiOMmoFF, Gaule, Ogata, Bechtereff {ibid., p. 499) ont eu de bons résultats avec du sublimé à 7 p. 100 (cinq à neuf jours, pas plus, et naturellement de petites pièces).

Les paragraphes suivants donnent des exemples de ces procédés.

683. Moelle épiniëre (Ciaglinski, Zeit. f, wiss. Mik.y VIII, 1, 1891, p. 19). — Solution deMuller, à renouveler tous les jours pendant la première semaine, et après cela aussi souvent qu'elle se trouble. Il faut trois ou quatre mois. Avec le liquide d'Erlicki on arrive au but en autant de semaines. Si Ton emploie ce réactif, il ne faut pas y laisser les pièces plus longtemps, sous peine de les voir se détériorer par la formation des précipités dont nous avons parlé (n^ 57).

684. Méthode de Betz (Betz, Arch.f. mik. Anat., 1873, p. 101). — On met la moelle épinière, lamoelle allongée et le pont de Varole (après avoir enlevé la dure-mère) dans un vase cylindrique avec de l'alcool à 73° ou 80® auquel on a ajouté de Tiode en quantité suffisante pour produire une coloration brun clair. Après deux ou trois jours on enlève la pie-mère et Tarachnoïde. A mesure que l'alcool se décolore, on ajoute de nouvelles quantités d'iode. Si Ton a réussi à bien enlever les membranes, on verra qu'au bout de six jours la préparation n'absorbe plus d'iode, et le durcissement préliminaire est terminé. On porte alors la préparation dans du bichromate de potasse à 3 p. 100, en ayant soin de la suspendre et de la munir en bas d'un petit poids pour l'empêcher de surnager ; on met le tout dans un lieu frais. Aussitôt qu'on voit paraître un trouble brunâtre dans le liquide et un dépôt brun à la surface de la préparation, le durcissement est achevé. On kve bien à l'eau et l'on conserve les pièces dans une solution de bichromate de G, S à 1 p. 100.

Le cervelet se traite de même. Il faut enlever les membranes aussi

complètement que possible avant de les placer dans l'iode ; si cette opération présente beaucoup de difficulté, on laisse macérer la préparation dans Talcool iodé qui a déjà servi au durcissement et qu'on diluera avant de s'en servir. Au bout de dix à dix-sept jours de traitement par l'iode, l'organe doit être suffisamment durci pour ne pas plier quand on le soulève sur un doigt placé sous l'éminence vermiforme. On complète le durcissement par le bichromate à 8 p. 100.

Le cei^eau, fendu dans le sens du plan sagittal médian du corps calleux, et débarrassé de ses membranes autant que faire se peut, est placé dans la même solution d'iode, dans un lieu frais. On aura soin d'ajouter de l'iode aussitôt que le liquide se décolore. Après vingt-quatre à quarante-huit heures, on achève de dépouiller l'organe de la pie-mère, et vers la même époque, ou un jour plus tard, on le porte dans une nouvelle quantité de solution d'iode dans l'alcool à 70**, où on le laisse jusqu'à ce que les hémisphères aient acquis une dureté telle qu'ils se laissent soulever sur deux doigts sans plier. On achève le durcissement par le bichromate à 4 p. 100. S'il se montre dans le liquide un dépôt brun excessif avant que l'organe ait acquis la consistance voulue, il faut le laver à l'eau et changer la solution de bichromate. Un hémisphère bien durci doit montrer une coloration brun jaunâtre d'égale intensité sur toute l'étendue d'une section faite à travers toute son épaisseur.

Pour des cerveaux qui ne sont pas frais, il faut prendre un alcool plus fort et accorder plus de temps au durcissement.

Le procédé de Betz est particulièrement indiqué pour des pièces volumineuses, et pour celles qui se trouvent dans un état de ramollissement pos^ moriem.

685. Cerveau (Bevan Lewis, Thelluman Brain, p. 102). — Alcool, 90 p. 100, vingt-quatre heures ; liquide de Mûller, trois jours ; après six jours, renouveler le liquide, ou bien substituer (ce qui vaut mieux) une solution de bichromate de potasse à 2 p. 100 ; après une semaine de traitement par cette solution, on passe à une solution de 4 p. 100 ; si au bout d'une semaine de séjour dans cette solution, la préparation n'est pas encore de la consistance voulue, on achève le durcissement par l'acide chromique (la concentration n'est pas indiquée).

686. Cerveau (Hamilton, Journ. of Anat. and PhysioL, 1878, p. 234). — Le cerveau doit être divisé en tranches de 1 pouce d'épaisseur, ou bien avoir sa surface incisée en de nombreux endroits. Il

40i CHAPITRE XXX

vaut mieux ne pas enlever les membranes. Mettre les pièces, supportées par de la ouate, comme nous Tavons dit au numéro 679, dans le mélange suivant :

Liquide de Mûller 3 parties.

Alcool ordinaire 1 —

Il se produit de la chaleur lorsqu*on mêle ces deux liquides; on laisse refroidir le mélange avant de s'en servir. On met le tout dans une glacière. Après vingt-quatre heures, on retourne les pièces. Après quinze jours à trois semaines, on fait une incision dans une partie de la préparation, et, si Ton constate que le liquide n'a pas pénétré à Tintérieur, on renouvelle le liquide. Si au contraire on trouve que la pénétration est suffisante, on met la préparation dans une solution de bichromate d'ammoniaque à 0, Î23 p. 100. Après une semaine, on la met dans une solution de bichromate à 1 p. 100; et après encore une semaine dans une solution à 2 p. 100, où on la laisse une semaine, ou plus longtemps si cela est nécessaire. Le durcissement achevé, on conserve les pièces, jusqu'au moment de les mettre en coupes, dans une solution d'hydrate de chloral à 2^5 p. 100. (Nous pensons que Thydrate de chloral rend ici le service d'atténuer la coloration jaune produite par les liquides chromiques.)