Fixation par les vapeurs osmiques. — C'est la OxaËîon

par les vapeurs osmiques qui est à la fois le procédé le plus commode et, en général, le plus efficace. Ainsi employé, l'acide osmique se montre beaucoup plus pénétrant, et donne des fixations beaucoup plus égales que quand on l'emploie en solution. Pour les cas où, comme pour les recherches sur les noyaux, on désire combiner l'action d'un acide organique avec celle du fixateur, il est facile d'employer les vapeurs dégagées d'un mélange d'acide osmiquc et d'acide formique ou d'acide acétique glacial (Gilson, La Cellule, I, 1885, p. 96). Les objets très petits (Infusoires, cellules isolées) peuvent être placés sur un porte-objets qu'on renverse au-dessus du -goulot d'un flacon contenant l'acide osmique ou le mélange. II suffit de quelques instants pour fixer de pareils objets. Des membranes ou des organes plus volumineux peuvent être fixés avec des épingles au fond d'un bouchon fermant le flacon qui contient le réactif. On les enlève aussitôt qu'ils commencent à brunir ; cependant, pour fixer des parties profondes, on peut prolonger la réaction pendant plu^ sieurs heures. 11 est bon de laver les pièces à l'eau avant de procéder à la coloration, mais ces lavages n'ont pas besoin d'être poussés aussi loin que pour les pièces fixées dans les solutions. Nous recommandons, comme colorants, le vert de méthyle pour les pièces destinées à être étudiées dans un milieu aqueux ; puis, pour les préparations au baume, le carmin à l'alun, le picrocarmtn, ou l'hématoxyline préparée selon la formule que l'on préfère-

• 89. Fixation par les solutions osmiques. — Lorsqu'on se

sert de l'acide osmique en solution, on emploie des concentrations variant de 0,05 à 2 p. 100, mais la tendance de la pratique récente paraît être d'employer des concentrations plus faibles. On prend, par exemple, pour les Infusoires, uqe solution de 0,8 p. 100, qu'on laisse agir pendant quelques secondes seulement ; pour les Porifères, 0,08 à 0,10 p. 100 pendant quelques heures ; pour les organes des Mollusques, 1 à 2 p. 100 jusqu'à vingt-quatre heures, selon le volume des pièces ; pour les épithéliums en général, 0,1 à 0, 8 p, 100, pendant une heure (nous donnons des généralisations de la pratique telle que nous la trouvons rapportée dans la littérature ; — pour •notre part, nous croyons que c'est là une fixation tout à fait exagérée) ; — pour les œufs méroblastiques, 0,1 p. 100, pendant vingt- (Juatre heures (nous pensons qu'ici il n'en faut pas moins) ; — pour

30 GtlAPlTRE III

les tubes nerveux à myéline, 0,1 à ï p. 100, pendant vingt minutes ou jusqu'à deux heures, selon les cas ; — pour les corpuscules tactiles^ 0,33 à 1 p. 100, vingt-quatre heures ; — rétine, 0,25 à 2 p. 100, -dix minutes à vingt-quatre heures (selon Tétat de division des pièces, et les éléments qu'on désire étudier) ; — pour les noyaux en général, 0,1 à 2 p. 100, pendant deux ou trois heures (pour des cellules isolées, cela nous paraîtrait exagéré).

Oq peut addilionner les solutions d'autres substances dans le but de les rendre plus pénétrantes. Ainsi on peut les mêler à l'alcool (Ranvier et ViGNAL). (Ranvier, Leçons cTAnat, Gén,, App, term. des muscles de la vie organique, p. 76. Vigçial, Archives de PhysioL, 1884, p. 181). — On fait un mélange, à volumes égaux, d'acide osmique à 1 p. 100 et d'alcool à 90 p. 100. — On le laisse agir, pour des objets pas trop gros — des embryons de quelques millimètres — pendant une heure ou deux. On lave pendant quelques heures dans de l'alcool à 80 p. 100, pour que la réduction de l'osmium continue. Pui& on peut laver à l'eau et colorer (quarante^huit heures) dans le picro-carmin ou l'hématoxyline. Cette méthode donne d'excellents xésultats. Viallanes Ta appliquée avec fruit à l'histologie des Insectes.

KoLOSSOW (Zeit' f, wiss, Mik., V, 1, 1888, p. 51) recommande une solution de 0,5 p. 100 d'acide osmique dans une solution de nitrate ou d'acétate d'urane à 2 ou 3 p. 100, le nitrate étant à préférer. Cette méthode s'applique, -dit-il, avec avantage aux imprégnations nerveuses.

Mann (Zeil, f. wiss. Mik.y XI, 4, p. 481) recommande un mélange fraîchement préparé de volumes égaux d'acide osmique à 1 p. 100 et d'une solution saturée de sublimé corrosif dans de la solution physiologique de sel (pour centres nerveux).

Si la flxation demande une immersion prolongée, elle doit être pratiquée dans un récipient bien clos, et tenu à l'abri de la lumière.

L'osmium colore en un noir des plus intenses toutes les substances graisseuses ; il convient donc de s'en servir avec beaucoup de précau» tion dans la préparation de pièces qui contiennent beaucoup de tissu adipeux.

40. Traitement ultérieur. — Les pièces fixées dans les solutions osmiques doivent être très soigneusement lavées à l'eau. On peut prolonger les lavages aussi longtemps qu'on veut, l'eau n'étant nullement nuisible aux pièces ainsi fixées. On peut également employer la glycérine diluée. Nonobstant les soins les plus minutieux apportés au lavage, il n'arrive que trop souvent qu'il reste des traces de la solution osmique dans les tissus; alors les préparations noirciront sûrement avec le temps. On peut plus ou moins prévenir ce noircissement en traitant les tissus avec des liquides légèrement alcalins. Schultze préconisait à cet effet l'acétate de potasse, qu'il employait

^ÎJip

AGENTS FIXATEURS ET DURCISSAISTS 31

comme milieu conservateur ; nous croyons cependant que cetle méthode n'est nullement infaillible. Fol recommande de laver avec une solution trës faible de carbonate d'ammoniaque. La simple immersion, pendant le temps voulu par la coloration, dans du carmin à Tammoniaque, ou même dans le picro-carmin, produit un tïïei semblable. Enfin, une méthode excellente est de mettre les pièces pendant vingt-quatre heures, ou plus, dans une solution de bichromate de potasse (soit dans la solution de MUlIer ou celle d'Erlickî], ou dans une solution faible (0,5 p. 100) d'acide chromique, ou dans la solution de Merkel, ou enfln dans une solution faible de ferrocyanure de potassium ou de cyanure de potassium. Le traitement par les solutions de bichromate a l'avantage de faciliter beaucoup la coloration par les carmins ou Thématoxyline. Les pièces déjà noircies peuvent être décolorées par Tune ou l'autre des méthodes que noua exposons au chapitre traitant des procédés de BLANcaiMENT, parmi lesquelles les procédés au peroxyde d'hydrogène seront des plus efGcaces.

OvERTON (Zeit. f. wiss. M/c., VII, 1, 1890) trouve que le blanchiment nécessaire peut s'effectuer en quelques minutes en un mélange d*une partie de peroxyde du commerce avec 10 à 25 parties d'alcool â 70 p. 100.

Nous recommandons les mêmes colorants que nous avons indîquéa pour les objets flxés à la vapeur d'osmium. Pour les fixations légères, le carmin à l'alun est excellent; mais pour les tissus un peu brunis il est souvent nécessaire d'avoir recours à un colorant plus énergique. En ce cas, on pourra employer avec avantage une coloration à l'hématéine (hématoxyline).

41. Acide chromique. Fixation. — L'anhydride chromique, CrO', se trouve dans le commerce sous forme de cristaux rouges qui se dissolvent dans l'eau en formant de Tacide chromique, H^Crû^ Ces cristaux étant extrêmement déliquescents, il est nécessaire de les conserver dans des flacons parfaitement bouchés à l'émeri. Il faut également avoir soin d'en tenir éloignées jusqu'aux moindres poussières organiques, le CrO' étant une substance qui se réduit très rapi* dément en sesquioxyde au contact des matières organiques. Nous recommandons d'en faire une solution à 1 p. 100, qui permet de préparer rapidement les mélanges et solutions plus allongées à mesure qu'on en a besoin.

Pour les fixations, on emploie en général des solutions de 0,1 p. 100, ou moins, jusqu'à 1 p. 100* On peut prolonger l'immersion

pendant plusieurs heures (objets embryologiques, quelques cellules). Les solutions très fortes, 2 à 8 p. 100, ne doivent agir que pendant très peu de temps. Pour les tissus nerveux, on prend des solutions très diluées, 0,02 à 0,125 p. 100, et on les laisse agir pendant plusieurs heures.

Pour le traitement ultérieur, voyez au numéro suivant

' Pour les durcissements, on emploie, en général, des solutions de 0,2 à 0,5 p. iOO, dans Teau. La durée de la réaction est de quelques jours à quelques semaines, selon la nature de l'objet. En général, on peut dire de l'acide chromique qu'il agit avec une très grande rapidité. 11 permet d'obtenir en quelques jours un degré de durcissement qu'on n'obtiendrait pas en plusieurs semaines, par ezeihple, avec le bichromate de potasse. Les membranes muqueuses s'y durcissent d'une manière satisfaisante en deux ou trois jours, le cerveau en six semaines environ. D'après Ranvier, il faut prendre, pour des fragments de tissu de 1 centimètre de côté, 200 grammes de liquide. Cet auteur dit en outre qu'on ne doit jamais employer des fragments ayant plus de 3 centimètres de côté, si l'on veut obtenir les meilleurs résultats. Pour durcir une moelle épinière d'Homme, il faut prendre deux litres de liquide, et le renouveler au bout de quelques jours. Il faut six semaines à deux mois pour compléter le durcissement.

Ainsi que nous l'avons déjà dit, on commencera par des solutions très faibles, dont on augmentera graduellement la concentration, si cela est nécessaire ; et l'on veillera surtout à enlever les objets de la solution aussitôt qu'ils ont acquis une consistance suffisante. Gela est particulièrement important dans le cas de l'acide chromique, qui a le défaut de rendre les objets très cassants pour peu que son action soit prolongée. On doit les laver à l'eau, et les mettre pour la conservation dans l'alcool à 90 degrés, (Mais voyez à ce sujet le paragraphe suivant.)

L'acide chromique est un durcissant de premier ordre ; son grand défaut est la facilité avec laquelle il rend les tissus cassants.

Les solutions d'acide chromique ne sont pas très pénétrantes, il convient donc d'employer des objets aussi petits que possible. Et pour cette raison aussi, il conviendra le plus souvent de ne pas employer l'acide chromique pur, mais l'un des mélanges avec Tacide acétique, l'acide osmique, Tacide picrique, Tacide nitrique, que nous allons décrire plus bas.

C'est surtout sous forme de ces mélanges que l'acide chromique se montre comme étant un des fixateurs les plus fidèles que nous connaissions. Il a le grand défaut de gêner beaucoup les colorations. Ce défaut est moins sensible avec les mélanges qu'avec l'acide pur. Ces mélanges ont aussi l'avantage d'atténuer un autre défaut de ce réactif, défaut qui consiste en ce qu'il précipite certains principes constituants^ liquides^ des tissus sous forme de filaments ou de réseaux. Ces réseaux sont souvent d'une régularité remarquable, et ont été

I ■HWi

AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 33

plus d'une fois décrits comme étant des éléments histologiques normaux.

L'action de Tacide chromique sur les éléments des tissus est tout à fait particulière ; il ne les coagule pas simplement, mais forme avec certaines de leurs substances constituantes des combinaisons chimiques insolubles. C'est une sorte de tannage. On comprend donc l'impossibilité de l'éloigner entièrement par les lavages, et la difficulté qu'on éprouve à obtenir de bonnes colorations par les méthodes ordinaires.

42. Acide chromique. Traitement ultérieur. — On lave à l'eau, et avec grand soin. L'eau doit être souvent renouvelée. Il peut être bon de mettre les objets pendant vingt-quatre heures au-dessous d'un robinet. Des lavages même beaucoup plus prolongés ne nuisent pas aux objets fixés par l'acide chromique. Pendant l'été il peut être utile d'ajouter un antiseptique quelconque (un morceau de camphre ou un cristal de thymol) à l'eau, pour prévenir le développement d'Infusoires.

Au besoin, on peut également laver à l'alcool au tiers, et même avec des alcools plus forts. Nous n'admettons pas la nécessité absolue d'employer Teau dans tous les cas.

Les meilleurs colorants sont l'hématoxyline et les anilines employées selon la méthode de Flemming.

Les objets qui ont été plongés pendant un certain temps dans les solutions diacide chromique (ou des sels de cet acide) acquièrent une coloration vert brun, due à une réduction partielle de Tacide chromique dans les tissus. On peut faire disparaître cette coloration en traitant les pièces par le peroxyde d'hydrogène, qui leur rend la couleur jaune propre de Tacide chromique (Unna, Arch, f. mxL AnaL, XXX, 1887, p. 47 ; Journ, Roy. Mie. Soc, 1887, p. 1060). Le lecteur voudra bien comparer ce que nous avons dit de Ja décoloration des pièces osmiques, plus haut, n* 40.

42 bû. Action de la lumière sur ralcool contenant des objets ohromiques. — Lorsqu'on met dans Talcool, pour la conservation ou pour le durcissement, des tissus qui ont été traités par Tacide chromique ou par un chromate, il se forme toujours, au bout de peu de temps, dans Talcool un fin précipité qui se dépose à la surface des préparations et forme sans doute un obstacle plus ou moins grand à la pénétration de Talcool. Le lavage préalable à Teau n'empêche pas la formation de ce précipité ; et le renouvellement de Talcool ne Fempéche pas de se reformer à plusieurs reprises. Hans Virchow a trouvé (Arch, /*. mik, Anat,, XXIV, 1885, p. 117) qu'on évite entièrement celte formation en prenant la précaution bien simple de maintenir les préparations dans l'obscurité. L'alcool s'y colore comme d'habitude en jaune, mais aucun précipité ne se forme. Virchow

ANAT. UICROSC. W

pense, d'après ses expériences, qu'en prenant cette précaution on peut sans inconvénient omettre, ou du moins abréger de beaucoup, le lavage à J'eau auquel on soumet habituellement les objets avant de les transporter dans TaLcool. Mais il ne faut pas pour cela négliger l'ancienne règle de renouveler Falcool à mesure qu'il prend la coloration jaune.

43. Acide chromique et alcool (E. Klein, Quart, Joum. Mie, Science, 1879, p. 126-7). — A deux volumes de solution d'acide chromique à 1/0 p. 100, on ajoute 1 volume d'alcool ordinaire. Klein s'est beaucoup servi de ce mélange comme fixateur dans ses recherches cytologiques, et a trouvé qu'il donnait souvent de meilleurs résultats que les fixateurs ordinaires (y compris l'osmium). Colorer à Thématoxyline.

Nous pensons qu'il peut y avoir souvent utilité d'ajouter de l'alcool aux solutions d'acide chromique, pour en augmenter la puissance de pénétration. Nous avons été un peu surpris en ne trouvant pas que de pareils mélanges aient été employés par aucun autre observateur que Klein.

44. Acide chromique et alcool [Liquide de Urban Pritciiard). — Acide chromique, 1 partie; eau, 20 parties ; esprit-dc-vin, 180 parties. — On Tait dissoudre l'acide chromique dans l'eau, et on ajoute l'esprit-de-vin. (Si Von ajoute directement l'alcool à l'acide chromique, il se produit une réaction d'une grande violence.) La solution prend bientôt une coloration brunu ire. Si, au bout de quelques jours, elle prend une consistance un peu gélatineuse, il faut la renouveler.

Ce liquide est particulièrement propre, selon Pritchard, au durcissement fj 'organes tels que la rétine, le limaçon. La durée de la réaction pour ces objets est de sept à dix jours. (Voyez Quart. Joum. Mie, Science, 1873, p. 427.)

45. Acide chromo-acétique (Flemming, Zellsbz,, Kern,-u.-Zellth,, p, 381). — Il est reconnu qu'il y a très souvent avantage à ajouter auK solutions d'acide chromique un peu d'acide acétique ou formique. Cela est favorable à la démonstration des éléments nucléaires en général, et surtout à la démonstration des figures achromatiques de la caryokinèse. Flemming recommande (surtout pour ce dernier objet) Taddilion de environ 0,1 p. 100 d'acide acétique à une solution diacide chromique de 0,2 à 0,25 p. 100. Colorera Thématoxyline. Ce mélange ne donne pas de préparations favorables pour la coloration uvec la safranine ou d'autres couleurs d'aniline. (Loc. cil,, p. 382.)

Voici une formule due à Ehlërs que je puis recommander comme excellente pour la conservation de beaucoup d'Annélides (vraisemblablement aussi pour d'autres organismes). — A 100 ce. d'acide chromique d'une concentration de 0,5 à 1 p. 100 on ajoute de 1 à 5 gouttes d'acide acétique crislallisable. La proportion indiquée d'acide acétique est sufOsanle pour neutraliser l'action ratatinante de l'acide chromique.

AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 35

45 bis. Acide picro-chromique (Fol, Lehrb.y p. 100).

Acide picrique, sol. concentrée dans Teau. 10 volumes.

Acide chromique à 1 p. ^ 00 25 —

Eau 65 —

Au moment de s'en servir, on peut ajouter environ 0,006 d'acide osmique, ce qui en rend l'action plus énergique. Laver légèrement à l'eau (qu'il vaut mieux prendre chaude, presque bouillante), puis à fond avec de l'alcool.

Fol dit, loc. cit, : c Ce réactif durcit les tissus d'une manière admirable, sans gêner en aucune façon les colorations; mais il a peu de puissance de pénétration et ûxe lentement, et pour cela ne peut être recommandé que pour des objets peu volumineux. »

Il me semble que ce liquide pénètre mieux que ne le pensait Fol. Il donne de très bons résultats avec des Annélides, et peut rendre de bons services pour des objets destinés à être montés en entier.

Ce liquide, avec l'addition d'un peu d'acide acétique, a été cité comme c liquide de Haensel >, je ne sais pas de quel droit.

46. Aoide ohrozno-formique (Rabl, MorphoL Jahrb., X Bd., 1884, p. 215-6). — A 200 grammes d'une solution d'acide chromique de 0,33 p. 100, ajoutez 4 ou 5 gouttes d'acide formique concentré. Le mélange doit être fraîchement préparé au moment de s'en servir. Fixer pendant douze à vingt-quatre heures, laver à Teau, durcir ensuite graduellement dans Talcool. Colorer à Théroatoxyline ou à la safranine.

47. Mélange chromo-osmique (Max Flesch, Arch. f. mik. Anat,, XYI, 1878, p. 300). — En combinant les solutions d'osmium et d'acide chromique, on produit un mélange qui est stable (ne se réduisant pas facilement), qui Qxe en général mieux que l'une ou l'autre de ces solutions employée seule, et qui permet d'y laisser des tissus pendant vingt-quatre à trente-six heures sans qu'ils se noircissent par l'osmium d'une manière excessive. Ce mélange a aussi l'avantage d'être d'une utilité très générale ; il peut être employé avec toutes sortes d'objets. On remarquera qu'il permet de combiner d'une manière utile l'action foudroyante de l'osmium avec l'action durcissante plus lente, mais plus égale, et pour cela peut-être plus Adèle, de l'acide chromique.

Max Flesch recommande un liquide composé de 0,1 partie d'acide osmique et 0,â5 partie d'acide chromique pour 100 parties d'eau.

48. Mélange chromo-acéto-osmlque. Liquide de Flemmino Ancienne formule^ mélange faible {Zellsubstanz.^ Kern-u^-Zellthei-

M CHAPITRE m

lunffj 1882, p. 381). — A la suite d'une élude approfondie des propriétés du mélange de Max Flesch, Flemming trouva qu'il était susceptible d'amélioration, surtout pour les études cytologiques. 11 reconnut que l'addition d'un peu d'acide acétique ou formique a pour efl'et non seulement de mieux différencier les éléments achromatiques des noyaux, mais, ce qui est encore plus important, de favoriser beaucoup les colorations avec l'hématoxyline, les carmins, ou les couleurs d'aniline. Il recommande donc d'ajouter au mélange de Max Flesch 0,1 p. 100 d'acide acétique glacial, soit la formule :

Acide chromique 0,25 p. 100 \

Acide osmique 0,1 — J dansTcau^

Acide acétique glacial .... 0,1 — ;

Flemming fait observer qu'il obtient les meilleurs résultats, comme fidélité de fixation des éléments cellulaires, avec des immersions de peu de durée, une demi-heure au maximum. Il lave à l'eau, et colore à rhêmatoxyline ou avec une couleur d'aniline. Je suis cependant bien convaincu que très souvent on obtient des résultats meilleurs avec des fixations beaucoup plus prolongées, jusqu'à vingt-quatre ou quaraale-huit heures ou plus. .

H n'est pas nécessaire de s'en tenir toujours aux proportions exactes de la Tormule que nous venons de donner ; aiosi Fol {Lehrb, d. vergL mik. Anat.y 1884, p. 100) conseille un mélange beaucoup plus faible en osmium que celui de Flemming. Il prend.

Acide chromique à 1 p. 100 2.5 Tolumes.

Acide osmique à 1 p. 100 2 —

Acide acétique à 2 p. 100 5 —

Eau 68 —

Soit en centièmes :

Acide chromique 0,25 p. 100 \

Acide osmique 0,02 — | dans Teau.

Acide acétique 0,1 — )

^ Pour fabriquer ce mélange avec les solutions normales, on n*a qu*à prendre :

Acicte chromique à 1 p. 100 23 volumes.

Acîd« osmique à t p. iOO 10 —

Acide acétique à 1 p. 100 10 —

Eau» 55 —

Si Ton conserve sa provision d'acide osmique sous forme d'une solution à 2 p. 100 dans de Tacide chromique à 1 p. 100, comme j*ai conseillé de le faire plus haut (§ 36), il faut prendre seulement 20 volumes d'acide chromique, 5 de la solution d'acide osmique, et 65 d'eau.

AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 37

Et CORi (Zeil. f, wiss, Mik.^ VI, I, 1890, p. 441) a préconisé un mélange contenant seulement 1 volume de solution d'acide osmique, au lieu de 2.

Dans la dernière édition nous avons dit qu'à la suite d'expériences comparatives avec la formule de Flemming el celle de Fol, nous avions trouvé que cette dernière nous avait donné les meilleurs résultats, tant pour les tissus des Vertébrés que pour ceux des Arthropodes. Nous avons trouvé la fixation tout aussi bonne, ou meilleure ; les pièces brunissaient beaucoup moins qu'avec le mélange de Flemming ; les lavages étaient plus faciles ; et nos pièces présentaient une consistance plus favorable pour les coupes. De plus, les colorations se faisaient bien plus facilement. Je dois dire maintenant que, pour ma part, après une expérience plus étendue, j'ai dû modifier ma manière de voir cet égard. Les mélanges plus faibles ont bien l'avantage de faciliter les colorations par les carmins, etc. ; mais comme fidélité de fixation je les trouve en général inférieurs aux mélanges plus forts, et je pense que le « Liquide fort » de Flemming dont nous allons parler dans le paragraphe suivant constitue en général un progrès.

La modification de von Bungner (voy. Zeit, f, tviss. MiL, X, 3, 1893, p. 392) consiste à doubler la dose d'acide acétique recommandée par Flemming. U me semble au contraire qu'il y aurait plus souvent utilité à la diminuer.

On peut laisser les tissus des jours entiers, voire même des semaines ou des mois, dans l'un ou l'autre de ces mélanges, sans crainte de les voir s'altérer d'une manière notable. Mais plus on prolonge l'immersion, et plus les colorations ordinaires deviennent difficiles ; de sorte que les couleurs d'aniline sont presque le complément obligé des fixations prolongées. La pratique ordinaire est de laver longuement à l'eau (ou mieux, dans de l'eau courante ; — on peut laisser dégorger les pièces pendant une heure ou plusieurs sous un robinet d'eau ordinaire), et de colorer à l'hématoxyline ou avec une couleur d'aniline. Les pièces bien lavées peuvent être colorées par les moyens ordinaires. Nous employons par exemple souvent le carmin à l'alun (étendu, avec une trace d'osmium), réactif peu énergique, mais que nous estimons être le plus fidèle de tous les carmins. Nous employons aussi avec un parfait succès le carmin au borax.

Les mélanges chromo-acéto-osmiques prennent certainement rang parmi les meilleurs fixateurs qui aient été imaginés.

Plusieurs auteurs ont formulé des critiques à propos de la fidélité de fixation du liquide de Flemming (voyez, par exemple, Faussek, Zeit, /. wiss.

Zool.j XLV, 1887, p. 694 ; Arnold, Ârch, f. mik, AnaL, XXX, 1887, p. 203 ; A. KOTLAREWSKY, MiUk. d. Naturf. Ges. Bem„ 1887 ou Zeit. f. wiss. Mik., lY, 3, 1887, p. 387). Je pense que ces critiques sont trop généralisées. Il va sans dire qu'il n'y a pas de réactif universel, et que le liquide de Flemming ne donnera pas de bons résultats si on l'emploie avec des objets auxquels il n'est pas adapté. Mais à cela près j'estime qu'il est de toute confiance. Son plus grand défaut, c'est d'être très peu pénétrant; il n'agit parfaitement qu'à travers une très faible épaisseur de tissu.

49. Mélange chromo-acéto-osmique de Flemming, nouvelle formule^ ou € mélange fort >. (Flemming, Zeitschr. f, wiss. MikToskopie, 1, 1884, p. 349.)

Acide chromique à 1 p. 100 15 parties.

Acide osmique à 2 p. 100 4 --

Acide acétique cristallisable 1 —

Si vous n'avez pas sous la main de la solution d'acide osmique à 2 p. 100, vous pouvez prendre :

Acide chromique à 10 p. i 00 Imparties.

Acide osmique à 1 p. 100 80 —

Acide acétique cristallisable 10 —

Eau 93 —

Ce liquide se détériore par réduction de l'acide osmique beaucoup plus facilement que ne le fait le € mélange faible >, ce qui est vraisemblablement un effet de la plus forte proportion d'acide organique qu'il contient. En conséquence, je recommande la pratique suivante, dont je me suis toujours bien trouvé. On fait et Ton conserve à part.

(A) Une solution contenant

Acide chromique à 1 p. 100 11 parties.

Eau 4 —

Acide acétique 1 —

et (6) une solution .d'acide osmique à 2 p. 100 dans de l'acide chromique à 1 p. 100. Pour faire le liquide définitif à mesure qu'on en a besoin, on n'a qu'à mêler quatre parties de A avec une partie de B. Ou si on le préfère, on peut se faire une provision d'acide osmique fit acide chromique dans les proportions indiquées par Flemming, et y ajouter 5 p. 100 d'acide acétique au moment de s'en servir.

Merk {Dcnkschr, ti. Math, Naluinv. CL d, K, Acad, d, Wiss. Wien., 1887 ; cf.

Zeil. /. ivLs. Mik., V, 2, 1888, p. 237) a proposé de faire à part une solution

de :

Acide chromique à 2 p. 100 7,5 parties.

Eau 3,5 —

Acide acétique 1 —

AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 39

. et d'en combiner 12 parties avec 8 parties d'acide osmique à 1 p. i 00 au moment de s'en servir. Cette pratique me parait inférieure à la mienne en ce qu'elle n'éloigne pas la difficulté connue qu'il y a à conserver l'acide osmique en solution dans l'eau pure.

Dans tous les cas, il est bon de ne pas préparer de grandes provisions du mélange à la fois, pour un autre motif. C'est que, l'acide osmique étant extrêmement volatil, les solutions qui ont servi pendant longtemps ne contiennent plus la proportion de cet ingrédient, qui est nécessaire pour balancer l'action gonflante de l'acide acétique. Si Ton est obligé d'employer de vieilles solutions, il convient d'y ajouter un peu d'acide osmique.

Comme pour le < Mélange faible », il n'est pas nécessaire dans tous les cas de s'en tenir rigoureusement aux proportions indiquées. Ainsi Carnoy (La Cellule, I, 2, 1885^ p. 211) a employé avec avantage un mélange d'un tiers plus fort en acide osmique et deux fois plus fort en acide chromique, à* savoir :

Acide chromique à 2 p. iOO (ou plus) 45 parties.

Acide osmique à 2 p. 100 16 —

Acide acétique cristallisablo 3 —

PoDWYSSOZKi (ZiEOLER's Beilraege z, paUi.Ânal,, I, 1886 ; cf. Zeit, /*. wiss, MiL, III, 3, 1886, p. 405} a recommandé (surtout pour des glandes) de dissoudre l'acide chromique dans de la solution de sublimé corrosif à 0,5 p. 100 dans l'eau, et de ne prendre que 6 à 8 gouttes d'acide acétique pour 19 ce. du mélange, la proportion d'acide osmique demeurant comme dans la formule de Flemming. Le sublimé est ajouté pour augmenter la puissance -de pénétration du mélange (mais cette addition est nuisible, dil-il, à la coloration des pièces).

Comme pour le < mélange faible », on lave longuement à l'eau (et même, encore plus longtemps) et l'on colore à Thématoxyline ou, s'il s'agit de coupes, par une couleur d'aniline. On peut sans inconvénient soumettre les pièces à une fixation très prolongée, vingtquatre heures ou plus ; mais pour le travail ordinaire une demi-heure suffira. Quelques auteurs recommandent même de laisser les pièces k l'occasion pendant des semaines entières dans le liquide.

En d'autres termes, le liquide de Flemming peut servir, soit pur, soit allongé d'eau, pour les durcissements aussi bien que pour les fixations proprement dites. Mais le plus souvent il suffira de peu de temps, le temps voulu pour assurer la pénétration et un peu plus. 11 ne faut pas craindre de prolonger les lavages à l'eau ; la plupart des tissus peuvent y rester pendant des journées sans inconvénient.

Le c mélange fort > ne brunit pas les tissus plus que le c mélange ^ faible », même plutôt moins.

Le tissu adipeux se noircit par Fun ou Tautre de ces liquides. On peut faire disparaître des tissus la graisse noircie en les traitant pendant quelques heures (après déshydratation par Talcool) avec de l'essence de térébenthine qui a été préalablement exposée au soleil pendant une heure ou deux. (Flemming, ZeiLf, wiss. Mik,, VI, I, 1889, p. 39, et VI, 2, 1889, p. 178.)

Le « mélange fort > fut imaginé en premier lieu dans le but très spécial de faciliter les recherches ayant pour objet de constater la présence de mitoses dans les tissus (et non d'étudier la structure intime de ces ûgures, ni pour servir aux recherches générales d'histologie), mais il s'est trouvé par la suite être en même temps admirable pour les travaux ordinaires. La plupart des auteurs l'emploient maintenant de préférence au « mélange faible ». J*ajouterai que dans mon expérience personnelle c'est celui de tous les fixateurs qui m'a rendu les plus grands services. Je pense bien que dans la plupart des cas il est supérieur au c mélange faible ».

60. Acide nitrique (Altmann, Arch. Anal, u, Phys., 1881, p. 219). — Altmann se sert d'une solution aqueuse titrée à environ 3 à 3,5 p. 100 d'acide pur. Une solution de cette concentration possède une densité de 1,02 environ, ce qui permet de titrer les solutions d'une façon aussi commode qu'exacte en se servant d'un aréomètre. (Une densité de 1,0201 correspond exactement à 3^ de l'échelle de Baume ; le titrage est donc des plus simples.) On peut se servir de solutions plus concentrées, mais elles ne donnent pas de résultats définitifs aussi bons.

On lave à l'alcool, et l'on peut colorer avec n'importe quelle teinture.

Les solutions plus concentrées d'acide nitrique ont été l'objet d'études sérieuses. Uskoff recommande pour des objets embryologiques une solution de 5 p. 100, qu'il laisse agir pendant dix à trente minutes. Wolff a employé avec de bons résultats une concentration de lO^p. 100 (œuf de la Poule).

Pour des préparations extemporanées de l'œuf des Astérides, Flemming a obtenu de bons résultats avec une solution de 40 p. 100. liis aussi a recommandé une solution de 10 p. 100. Altmann a essayé cette concentration, et a trouvé qu'elle ne permettait pas de démontrer les figures nucléaires. Il pense que les solutions concentrées coagulent trop fortement les albuminoîdes solubles des tissus, ce qui a pour effet de nuire à la différenciation optique des structures.

Pour les lavages, on peut prendre, au lieu d'alcool, une solution aqueuse d'alun de 1 à 2 p. 100 (Uskoff, Rabl.).

On peut aussi employer l'alcool pour préparer le liquide fixateur. On mélange à cet effet 3 volumes d'acide nitrique avec 97 volumes d'alcool à 70 p. 100. (Fol ; inédit. Nous devons cette indication à l'obligeance de M. le professeur Fol.)

J'ai essayé consciencieusement l'acide nitrique d'Altraann, et je l'ai abandonné parce que je l'ai trouvé être un fixateur décidément trop peu énergique.

Pour les durcissements on l'emploie quelquefois à une concentration de

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AGENTS FIXATEUaS ET DURCISSANTS 41

3 à 10 p. 100. On le laisse agir pendant deux ou trois semaines. Employé de cette manière (10 à 12 p. 100), il fournit des préparations de Fencéphale qui sont en même temps très dures et flexibles.

Benda (Verh. anaL Ges. Wurzburg, 1888; Ergeb, der Anal., I, 1891, p. 7) fixe pendant vingt-quatre à quarante-huit heures dans de Tacide nitrique à 10 p. 100, puis porte les pièces, sans lavage préalable, dans une solution saturée de bichromate de potasse allongée de 3 volumes d'eau. On augmente graduellement la concentration du bichromate, de manière à arriver en deux ou trois jours (ou jusqu'à quatorze jours pour Fencéphale et la moelle épiuière) à une concentration de 1 volume de la solution de bichromate pour un volume d'eau. Il est dit que ce procédé peut s'appliquer à des pièces assez volumineuses (testicule entier de l'Homme, etc.), et qu'il leur donne une consistance extrêmement dure.

51. Acide chromo-nitrique {Liquide de Perenyi; Zoologischer Anzeiger, V, 1882, p. 459).

Acide chromique à 0,5 p. 100 3 parties.

Acide nitrique à 10 p. 100 4 —

Alcool 3 —

On mêle ces liquides, et au bout de peu de temps on obtient une solution d'un beau violet.

On y laisse les objets (du moins si ce sont des œufs) pendant quatre à cinq heures ; on les met ensuite pendant vingt-quatre heures dans de Talcool à 70 degrés, puis pendant quelques jours dans de Talcool fort ; et finalement pendant quatre à cinq jours dans de Talcool absolu. Au bout de ce temps, ils ont acquis la meilleure consistance pour être coupés au microtome. Des œufs ainsi préparés se coupent comme du cartilage ; ils ne sont pas le moins du monde poreux, et les blastomères et leurs noyaux se trouvent parfaitement bien conservés.

J*ai employé le liquide de Perenyi avec des objets très variés (mais surtout des animaux marins), et je Tai toujours trouvé excellent. 11 fixe assez rapidement, de sorte qu'il est rarement nécessaire d'y laisser les objets aussi longtemps que le dit Perenyi pour les œufs. £t il n'est pas nécessaire en général de les durcir longuement dans Talcool ; un simple passage à travers les alcools usuels suffit le plus souvent. Dans les fixateurs plutôt doux, c'est un des meilleurs que faie essayés.

Perenyi a donné plus tard une formule modiûée, pour la fixation d'embryons de Lacerta, Nous la donnerons dans les c Méthodes embryologiques >.

Les instructions que donne Perenyi pour l'emploi des matières colorantes dissoutes dans le liquide fixateur me paraissent peu rationnelles, et je les supprime.

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