ACIDES ORGANIQUES ET AUTRES AGENTS

75. Acide picrique. — Cet acide se trouve dans le commerce sous forme de beaux cristaux d'un beau jaune serin. Ces cristaux stables, hexagonaux, peuvent commodément être conservés en nature. Ils se dissolvent dans Teau et dans Talcool. Dans Teau froide, ils se dissolvent en raison d'environ 1 partie pour 75 d'eau ; dans l'eau chaude ils sont beaucoup plus solubles.

Pour les fixations, on emploie en général la solution aqueuse saturée à froid. On doit toujours avoir soin d'employer des solutions fortes toutes les fois qu'il s'agit de faire des coupes ou de préparer des organes avec les éléments in silu, parce que les solutions faibles macèrent les tissus. Pour l'étude d'éléments cellulaires isolés, on peut prendre des solutions faibles.

On peut laisser les objets à fixer très longtemps — jusqu'à vingt-quatre heures, par exemple — dans cet acide, sans qu'ils en souffrent. Il est cependant extrêmement pénétrant, et peut fixer de petits objets en quelques instants.

On lave toujours à Valcool, pour les motifs que nous avons exposés dans l'introduction, au numéro 5. Cette règle ne souffre pas d'exception pour l'acide picrique pur, et s'applique également à l'acide picro-sulfurique, l'acide picro-nitrique et l'acide picro-chlorhydrique. L'acide picro-chromique permet un court lavage à l'eau (Fol). Pour la même raison, on doit éviter l'emploi des liquides aqueux pendant tout le cours de la préparation ultérieure ; on colore donc avec des teintures alcooliques. (On peut à la rigueur se servir de certaines teintures aqueuses, à condition qu'elles contiennent une proportion suffisante de quelque réactif durcissant pour leur permettre de ne pas déformer les cellules ; et l'on a cité à ce propos le picro-carmin, qui remplirait celte condition en vertu de l'acide picrique qu'il contient.)

C'est avec l'alcool à 70 degrés que l'on commence les lavages en général. !1 faut le renouveler aussitôt qu'il devient trouble, et continuer les lavages us qu'à ce que les tissus soient bien débarrassés de la coloration jaune que leur a donnée l'acide picrique. Les lavages seront facilités de beaucoup si l'on emploie l'alcool à chaud ; à la température de 40<^ l'acide picrique est en

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effet presque deux fois aussi soluble dans cet alcool qu'à la température normale (Fol).

Jelinek {Zeit. f. wiss. Mik,, XI, % 1894, p. 242) dit que Textraction de Tacide est notablement activée par l'addition de carbonate de lilhine à Talcool de lavage. On y ajoute quelques gouttes d'une solution aqueuse saturée. Il se produit un léger précipité. On introduit maintenant les objets dans cet alcool trouble et l'on remarque qu'il commence à s'éclaircir en même temps qu'il prend une coloration jaune et que les objets se décolorent. On 'ajoute de nouvelles quantités de la solution de carbonate jusqu'à ce que la réaction ne se produise plus et que les objets soient devenus incolores.

C'est l'un des grands avantages de l'acide picrique, qu'il se laisse entièrement extraire par l'alcool et laisse les tissus dans un état où ils sont susceptibles des plus belles colorations par tous les colorants ordinaires.

Une qualité très précieuse, c'est sa grande puissance de pénétration. Cette propriété, jointe à cette autre, qu'il ne nuit nullement aux éléments des tissus lors d'une immersion prolongée, fait des liquides picriques les fixateurs par excellence des Arthropodes.

En dehors de cela il laisse à désirer sous beaucoup de rapports. Les lavages nécessaires pour l'éloigner des tissus n'opèrent que très lentement ; il faut souvent des semaines entières pour les mener à bonne fm. Il est un fixateur très peu énergique : on lui souhaiterait le plus souvent une action coagulante beaucoup plus prononcée. On n'arrive à parer que partiellement à ces deux inconvénients en combinant l'acide picrique avec d'autres réactifs, comme dans les mélanges qui vont suivre.

76. Acide picro-sulforique {Liqueur de Kleinbnbbrg ; Quart. Joum. Mie. Science, avril 1879, p. 208. — Formule de Paul Mayer; Joum. Roy. Mie. Soc, N. S., 2, 1882, p. ,867» D'après Whitman). —

Nous supprimons la formule originelle donnée par Kleinenberg pour la préparation de ce liquide, celle que nous donnons étant beaucoup plus commode. Prenez :

Eau distillée 100 volumes.

Acide sulfurique concentré ....... 2 —

Mêlez et ajoutez de l'acide picrique autant qu*il s*èn dissoudra.

Ce sera environ 0,25 p. 100, Tacide picrique étant beaucoup moins soluble dans Teau additionnée d'acide sulfurique que dans l'eau pure.

Filtrez et ajoutez 3 volumes |d'eau (excepté pour les Arthropodes, pour lesquels on emploie la solution non diluée). (N'y aurait-il pas avantage à réserver le nom d'< acide picro-sulfurique » à la solution non diluée, et à appeler < Liqueur de Kleinenberg » la solution étendue ? La solution non diluée est indispensable pour les Arthropodes, et nous paraît mériter une désignation propre.)

On laisse les objets dans ce liquide, selon leurs dimensions, pen-

dant trois ou quatre heures, ou même jusqu'à vingt-quatre heures (les immersions prolongées ne nuisent nullement aux objets). On les porte alors dans de Talcool à 70 degrés, ou on les lave comme nous l'avons dit pour Tacide picrique. Nous croyons devoir répéter ce que nous avons déjà dit plus d'une fois, que les objets Gxés dans les liquides picriques ne doivent jamais être lavés à l'eau. On colore comme nous Pavons dit pour l'acide picrique.

Il y a qaelqaes précautions à prendre avec l'acide picro-sulfurique. Quoiqu'il se diffuse assez rapidçment à travers les cuticules, il va sans dire que la chitine épaisse s'oppose à son passage. Les Arthropodes un peu gros, les Insectes et les Isopodes de grande taille, doivent être ouverts et injectés largement avec le liquide à l'aide d'une pipette. De plus, et ceci est un point très important, on emploiera des quantités très grandes de liquide, et [on aura le plus grand soin de renouveler le liquide aussitôt qu'il sera devenu trouble. On ne doit jamais laisser les objets pendant un temps considérable dans un liquide qui n'est pas parfaitement limpide.

Ce liquide est un fixateur plus énergique que l'acide picrique pur. Il a en outre l'avantage de se laisser enlever au lavage bien plus facilement. Pour la zoologie marine, il a la propriété très précieuse de débarrasser les organismes des sels de l'eau de mer en même temps qu'il les fixe.

Il a quelques désavantages qui lui sont ]iarticuliers. À cause de la présence de l'acide sulfurique, ce réactif gonfle le tissu conjonctif ; c'est assez dire que pour les Vertébrés il n'est que d'une application restreinte. Puis, pour les objets qui contiennent des éléments calcaires, il n'est pas à recommander, car il dissout la chaux et la laisse ensuite précipiter dans les tissus sous forme de cristaux insolubles de gypse. Pour de tels objets, il est préférable d'employer un des liquides suivants, acide picro-ni trique, ou acide picro-chlorhydrique.

Dans beaucoup d'objets il produit des gonflements et des macérations. D'après une expérience assez étendue, je dois dire que pour la fixation d'organismes délicats et ayant dans leur composition beaucoup d'eau, tels que les Méduses, ce liquide ne vaut rien. Pour les Arthropodes je trouve que c'est un réactif excellent à cause de sa grande puissance de pénétration pour la chitine. Mais pour le travail ordinaire il est beaucoup moins recommandable, et il me parait certain que c'est surtout grâce au prestige de l'autorité de Kleinenberg qu'il a pu jouir aussi longtemps de la faveur des anatomistes. On revient maintenant de cet engouement, et l'on fait bien.

J'ajouterai que dans la plupart des cas le liquide no7i dilué m'a donné de meilleurs résultais que le liquide étendu de Kleinenberg.

77. Acide picro-nitrique. (PaulMAYER; 3fitt.Zool.Stat. Neapel, 1881, p. 5.)

Eau distillée 100 volumes.

Acide nitrique (Je 2o p. lUO Az^O"). ... 5 — Acide picrique, autant qu'il s'en dissoudra.

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Propriétés très semblables à celles de Tacide picro-sulfurique, avec l'avantage de prévenir la formation decristaicx degypsCy et rinconvénient d*ètre beaucoup plus difficile à éloigner des tissus par le lavage. Whitman {Joum. Roy. Mie. Soc, N. S. 2, 1882, p. 868) rapporte que Paul Mayer le recommande beaucoup, et trouve qu'avec des œufs qui contiennent beaucoup de deutoplasme, comme ceux de Palinurus, il donne de meilleurs résultats que Tacide nitrique, l'acide picrique ou Tacide picro-sulfurique.

78. Acide picro-chlorhydrique. (Paul Mayer, Mitlh. Zool. Stat. NeapeLy 1881, p. 5.)

Eau distillée 100 volumes.

Acide chlorhydrique (à 25 p. 100 HCl) 8 —

Acide picrique, autant qu'il s'en dissoudra.

Propriétés semblables à celles de l'acide picro-nitrique.

79. — Note sur la décalcification au moyen de Pacide picro-nitrique ou l acide picro<hlorhydrique. Il vient naturellement à Tesprit que ces deux liquides pourraient être très utiles pour les décalcifications. Paul Mayer fait observer à ce sujet que l'action en est extrêmement rapide et que le dégagement de Tacide carbonique est souvent assez abondant pour produire des lésions dans les tissus par une action mécanique ; de sorte qu'il est souvent préférable d'employer l'acide chromique, d'autant plus que ce durcissant énergique sert d'une façon très efficace à agir contre raÎTaissement des tissus qui peut résulter de la disparition de leur charpente calcaire*

80. Acide picro-chromique. — Nous en avons parlé au numéro 45 bis.

81. Mélanges picro-osmiques. ~ Flemming (Zells. Kern-u.-Zellth., p. 381) a essayé des mélanges faits en substituant à Tacide chromique des mélanges chromo-osmiquqs (Max Flesgii et Flemming) de Tacide picrique à 50 p. 100. {Sic. Flemming a sans doute écrit 0,5 p. 100.) Ces mélanges donnent des résultats identiques à ceux des mélanges chromo-osmiques, si ce n'est qu'ils rendent les colorations encore plus difficiles.

0. vom Rath {Zool. Anz., XIV, 1891, p. 363) s'est bien trouvé du mélange suivant: Acide picrique, sol. sat. aq., 1000 ce., acide acétique cristallisable 4 ce. et acide osmique 1 gramme. Fixer pendant une heure environ, laver seulement quelques minutes à Teau et porter dans l'alcool. Si on laisse les pièces trop longtemps dans le mélange, elles brunissent beaucoup.

82. Alcool picrique (Gage, Proc. Amer. Soc. Mie-, 1890, p. 120;/ou?7i. Eoy. Mie. Soc, 1891, p. 418). — Alcool à 95 p. 100, 250 ; eau, 230 ; acide picrique, 1. Fixer pendant environ vingt-quatre heures, laver pendant un jour dans de Taicool de 67 à 70 p. 100, puis pendant encore un jour ou plus dans de l'alcool à 75 à 82 p. 100.

83. L'acide acétique et racido formique sont surtout employés comme fixateurs pour les noyaux. On peut dire d'une manière générale que les meilleures concentrations se trouvent entre les limites de 0,2 à 1 p. 100. Des concentrations supérieures, 5 p. 100 et plus, fixent bien les éléments nucléaires pendant un moment, mais ensuite les font gonfler et pâlir, ce qui n'arrive pas avec les solutions très diluées. Voyez, à ce sujet, Flemming, Zellsubstanz, etc., p. 102-103 et 380.

L'action de ces deux acides est à peu près la même. L'acide acétique a sur Tacide formique l'avantage d'être cristallisable, ce qui permet de titrer facilement les solutions, en prenant pour point de départ VAcidum acelicum glaciale.

L'acide acétique concentré est souvent fort utile, comme je puis en témoigner, pour tuer et fixer en même temps des organismes extrêmement contractiles, tels que certains Vers, Nudibranches et Cœlentérés. 11 a la précieuse qualité de tuer avec une rapidité foudroyante, son action étant peut-être plus rapide que celle d'aucun fixateur connu, sans excepter le sublimé bouillant. Il a une tendance marquée à fixer les organes dans Vétal d'extension^ ce qui est naturellement une qualité précieuse. 11 a aussi l'avantage de ne pas causer d'opacité dans les tissus, qu'il laisse aussi transparents que pendant la vie. La raison pour laquelle on ne l'emploie pas plus souvent, c'est que son action laisse à désirer sous le rapport de la bonne conservation des fins détails histologiques et cytologiques. Lemodusoperandi est d'inonder brusquement les organismes à fixer avec de l'acide acétique cristallisable ; les y laisser le temps nécessaire pour qu'ils en soient pénétrés — temps qui ne doit pas dépasser cinq à six minutes ; puis les transporter dans l'alcool à 50 ou 70 degrés qu'on a soin de iienouveler fréquemment jusqu'à ce que l'acide ait été éloigné. Cette méthode, quelquefois précieuse, est due à van Beneden, voyez « TtJNicffiRS ^.

S. Le BiÂNCO ajoute à l'acide acétique concentré un dixième de solution d'acide chromique à 1 p. 100. Celte petite quantité sert à combattre utilement l'action trop ramollissante de l'acide organique.

J'ai employé de la même manière le jus de citron, qui m'a donné des résultats admirables sous le rapport de l'extension, mais je ne suis pas encore à même de me prononcer sur l'état de conservation des tissus.

83 bis. Alcool acétique. (Garnoy, La Cellule III, 1, 1886, p. 6, et 1887, 2, p. 276 ; van Beneden et Neyt, Bull. Acad. Roy. Sci. Belg.y XIV, 1887, p. 218; Zacharias, Anal. Anz., III, 1888, p. 24-27 ; van Geuuchten, ibid., 8, p. 237.) — Réactif important. Garnoy en a donné deux formules. La première :

Acide acétique cristallisable 1 volume.

Alcool absolu 3 —

La deuxième :

Aide acétique cristallisable 1 volume.

Alcool absolu 6 —

Chloroforme 3 —

L*addition de chloroforme rend Tacliondu mélange plus rapide.

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Van Benbden et Neyt prennent des volumes égaux d'acide cristallisable et alcool absolu.

Zacharias prend :

Acide acétique cristallisable 1 volume.

Alcool absolu 4 —

Acide osmique, quelques gouttes.

L'alcool acétique est un des fixateurs les plus pénétrants et des plus rapides qui existent. Il conserve admirablement les noyaux et admet toutes les colorations. Il fut imaginé par les auteurs cités pour la fixation des œufs d'Ascaris, objet des plus difficiles ; mais il peut également servir pour beaucoup de tissus.

Lavez à Talcool, et dans le traitement ultérieur évitez autant que possible remploi de Teau.

84. Liqueur aux sels de cuivre (Liqueur de Ripart et Petit). Carnoy. La Biologie cellulaire, p. 95.

Eau camphrée 75 gr.

Eau distillée 75 —

Acide acétique cristallisé 1 —

Acétate de cuivre 0 — 30

Chlorure de cuivre 0 — 30

Pour éviter le dépôt de cristaux de camphre dans les préparations, on emploie de Teau camphrée non saturée.

Cette liqueur ne fixe que très modérément, mais conserve néanmoins d*une manière admirable les éléments cellulaires. Elle à le grand avantage de « permettre à l'observateur d'y ajouter, sans amener de précipité, divers corps dont les circonstances lui dictent remploi. Ainsi, on peut y ajouter impunément une goutte d'acide osmique, seul ou additionné d'eau de brome, pour fixer davantage les cellules riches en protoplasma. La coloration du noyau s'obtient instantanément au sein de cette liqueur par le vert de méthyle, et elle s'y conserve sans altération pendant longtemps. » [Loc. cit., p. 127.) C'est un réactif indispensable pour les travaux délicats qui reposent sur l'observation de eellMles fi^aîches, isolées par la dissociation ou observées ïn situ.

85. L'acétate d'uranium a été employé par Schenk (voy. Mitlh, aus. d. embi'yol. Inst, Wien, 1882, p. 95). Il convient de se servir d'une solution saturée dans Teau. C'est un réactif qui, d'après Gilson, donne quelquefois (pas toujours) de fort bons résultats, surtout pour des tissus d'Arthropodes. < H a l'avantage sur bien d'autres agents fixateurs de ne pas précipiter le vert de méthyle, et de fixer les cellules modérément, sans les contracter. Il

a aussi la propriété, signalée par Schenk, de diffuser assez facilement à travers les cuticules. (Gilson, Spermatogenèse des arthropodes y dans La Cellule, I, 1885, p. 141.)

86. L'iode est un réactif durcissant, qui pénètre rapidement, et qui, quoiqu'il ne conserve pas les cellules avec une grande fidélité, peut cependant rendre des services pour des préparations exlemporanées. On s'en sert en solution aqueuse dans Tiodure de potassium. Voici, d'après Fol, la formule de la solution de Lugol.

Eau 100 parties.

lodure de potassium 6 —

Iode 4 —

Fol prend une solution saturée d'iode dans une solution aqueuse concentrée d'iodure de potassium et l'étend selon les cas de 100 à 500 volumes d'eau. {Fol, Lehrb.y p. 103.)

S. Kent a trouvé ce réactif souvent meilleur que l'acide osmique pour fixer les Infusoires.

Nous faisons observer qu'il fonctionne comme fixateur dans le < Sérum iodé ».

On peut fixer instantanément les petits objets par les vapeurs d'iode. On chauffe des cristaux d'iode dans un tube à essais jusqu'à ce que les vapeurs se dégagent ; puis en inclinant le tube on les fait couler sur la préparation déjà placée sur un porte-objet. Le porte-objet doit alors être chauffé à environ 40^ G. pendant deux ou trois minutes pour chasser l'iode de la prépanation. (Overton, Zeil. f. wiss. Mik., VII, I, 1890, p. 14.)

87. Les alcools. — Sous ce titre nous comprenons les divers mélanges d'alcool éthylique avec de Teau dont on se sert en histologie. De tous ces mélanges, il n'y a guère que les alcools dilués, au tiers environ, d*un côté, et, de l'autre, l'alcool absolu, qui puissent être considérés comme des agents flxateurs. Valcool absolu a l'effet d'un fixateur parce qu'il tue et coagule les éléments avec une telle rapidité qu'ils sont fixés dans leur forme avant que l'action déshydratante, pourtant si énergique, de cet alcool, ait eu le temps de déformer les structures molles. Il y a bien déshydratation et ratatinement, mais c'est l'action coagulante rapide qui l'emporte, et l'on obtient des fixations qui peuvent quelquefois compter parmi les meilleures. L'action des alcools dilués repose sur un principe opposé. Dans ce cas, on choisit une dilution telle que l'alcool, qui, tout en gardant une propriété coagulante suffisante, contienne cependant en même temps une proportion suffisante d'eau pour que son action déshydratante soit pratiquement nulle ou du moins insignifiante. C'est Vaicool au tiers qui réalise le plus complètement ces conditions. Dans les alcools intermédiaires entre celui-ci et l'alcool absolu, c'est l'action déshydratante qui a le dessus, de telle sorte qu'on ne peut

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pas les employer seuls comme fixateurs. Nous ferons observer cependant qu'on peut très bien les employer comme véhicules d'un flxateur foudroyant, et qu'il est quelquefois même avantageux de le faire. Nous pouvons ainsi augmenter la puissance de pénétration du sublimé corrosif. On peut également combiner avec l'alcool Tacide chromique ou l'acide nitrique. C'est en général Yalcool à 70 degrés qu'il convient d*employer pour ces sortes de mélanges.

Voici, d'après Gay Lussac, un tableau destiné à donner la proportion d'eau qu'il faut ajouter à 100 volumes d'alcool d'un titre supérieur pour le ramener à un titre inférieur demandé. On cherche dans la colonne horizontale, en haut, le titre de l'alcool à diluer, et dans la colonne verticale, à gauche, celui auquel on désire arriver. Le chiffre inscrit à l'angle où se rencontrent le prolongement en bas de la première colonne et le prolongement à droite de la seconde indique en volumes la proportion d'eau qu'il faut prendre.

Ainsi, pour ramener 100 volumes d'alcool à 70 p. 100 au titre de 30 p. 100, on trouve qu'il faut 136 volumes d'eau.