Autres colorants nucléaires par voie rég^^essive

Dans les paragraphes précédents ont été décrits les procédés les plus usités. Il en est cependant d'autres qui donnent de bons résultats. Flemming (Arch, f, mik, Anat., XIX, 1881, p. 317 et 742) a expérimenté avec les couleurs suivantes : safranine, rose de Magdala, dahlia, mauvéine, rouge fluorescent, vert solide, ponceau, orange, éosine,

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SAFRAMNE ET AUTRES COLORANTS NUCLEAIRES 137

fuchsine, brun Bismarck. (La plupart de ces couleurs provenaient de la fabrique de Bindschedler et Busch, à Bâle.)

Il a trouvé que Véosine et le ponceau ne doivent pas être employés, parce qu'ils ne donnent pas de coloration nucléaire. Vorange colore avec précision, mais trop faiblement. Toutes les autres couleurs donnent de bons résultats. La mauvéine et le rouge fluorescent colorent souvent quelques noyaux beaucoup plus fortement les uns que les autres dans une même préparation. Le vert solide donne une coloration plus faible que la safranine et le rose de Magdala; il exerce une action spécifique sur la charpente nucléaire et les nucléodes. La fuchsine donne une coloration plus faible que le rose de Magdala, la safranine, le dahlia et la mauvéine; le brun Bismarck ne réussit pas bien avec les préparations à l'acide chromique : avec les préparations alcooliques récentes il donne une bonne coloration nucléaire qui manque cependant de précision. Les meilleurs résultats ont été obtenus en général avec la safranine, le 7*ose de Magdala et le dahlia (le violet de gentiane n'était pas connu à cette date).

La Fuchsine est le nom de toute une série de sels de rosaniline qui se trouvent dans le commerce sous les marques de fuchsine, rouge d'aniline, rubine, roséine, Magenta, Solferino, coralline, etc., et qui diiTèrent plus ou moins dans leurs réactions. Graser {Zeit. f. wiss. Mik,, V, 3, 1888, p. 378) dit avoir obtenu les meilleurs résultats avec celte couleur de la manière suivante. Ou bien on l'emploie comme nous le dirons plus loin pour le violet de méthyle (n** 179). Ou bien, on l'emploie d'après la méthode de Baumgarten en coloration double avec le bleu de méthylène, comme nous le dirons au chapitre des Colorations combinées.

La fuchsine carboliq[ue de Ziehl est une teinture qui est souvent recommandée. Je n'ai pas pu trouver la source originelle de publication et je cite d'après Zeit, f, wiss. Mik., VII, 1, 1890, p. 39.

La solution colorante se compose de :

Fuchsine 1 gramme.

Acide phénique cristallisé 5 —

Alcool iO —

Eau distillée 100 —

Ou bien on prend une solution d'acide phénique à 5 p. 100 dans l'eau et on la sature de solution alcoolique concentrée de fuchsine. (Le point de saturation se manifeste par la formation d'une pellicule à reflet métallique à la surface du liquide.) On décolore à l'alcool suivi d'essence de girofle.

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Le Brun Bismarck donnerait d'après Keiser (Bibl, ZooL, VII, i II] le, 1891; Zeil. f. wiss, Mik., VIII, 3, 1891, p. 363) de bons résultats comme suit. On colore pendant quarante-huit heures à une température de 60<> C. dans une solution saturée de la couleur dans de Talcool à 60 p. 100, bouillant. On décolore dans de Talcool à 60 p. 100 additionné de 2 p. 100 d'acide chlorhydrique ou 3 p. 100 d'acide acétique. Nous parlons plus loin du brun Bismarck comme colorant progressif.

La Nigrosine soluble à Teau est une des indulines, petit groupe de couleurs classé par Ehrlich dans les couleurs « acides > sulfoniques, par Benedikt dans les couleurs < basiques > (apparemment il se trouve dans le commerce les deux sortes de couleurs, des sels basiques, et des acides sulfoniques).

Cette couleur a été recommandée comme réactif colorant des noyaux par Errera (Proc.-Verb. Soc. Belge de Mie, 1881, p. 13i). Je Tai essayée en teinture par la méthode régressive et j'ai obtenu de très belles colorations nucléaires. La couleur s'est montrée très résistante à l'alcool, et je pense qu'elle mérite d'être l'objet d'études plus approfondies.

Pfitzer (Deutsch, Botan. Ges., I, 1883, p. 44 ; Zeit. /*. wiss, Mik., 1, 1884, p. 116) dissout la nigrosine dans une solution saturée d'acide picrique dans Teau. On peut employer ce liquide pour fixer et colorer en même temps. On lave à l'eau ou à l'alcool dilué ; on monte à la glycérine ou au baume. Pfitzer dit que la méthode est utile pour fixer et colorer des organismes sur le porte-objet. Martinotti (Zci7. /*. wiss. Mik., 1885, p. 479) recommande la solution alcoolique de picronigrosine pour l'étude des centres nerveux.

Freeborn a employé un semblable liquide pour le tissu conjonctif. Pour ces deux derniers procédés voyez aussi dans la Deuxième Partie.

Peuvent être aussi employés en coloration régressive :

Le Violet de xnéthyle (d'après Martinotti et Resegotti au mieux selon leur procédé de décoloration que nous avons donné au n^ 167) ;

La Trapœollne OOO, n? 2 (Orange II, Chrysauréine, Betanaphtolorange), etc. ;

La Rocelline (Cchtroth, Orseilline n^ 3, Robidine, Rauvarienne). Ces deux dernières couleurs sont citées d'après Griesbacii (Arch- /*. mik. Anal., XXII, p. 132).

La Benzoazuriae a été préconisée par Martin {Zeil, f. wiss, Mik., VI, 2, 1889, p. 193). Colorer pendant une heure ou deux dans une solution aqueuse diluée, et décolorer dans de l'alcool additionné d'acide chlorhydrique (0,5 à 1 p. 100). Ce colorant a été recommandé pour Tétude de la ligne d'ossification par Zscuokke {op. cit., X, 3, 1893, p. 381).

Le Bleu de Méthylène s'emploie aussi en coloration régressive. On emploie une solution aqueuse assez forte, et l'on décolore à l'alcool pur. Cette couleur a le défaut d'être très peu résistante à l'alcool. D'après Sqdire (Melhods, p. 36) on en augmente sensiblement la résistance en lavant bien à l'eau avant de passer à l'alcool. Voyez aussi n^ 162 bis,

La Thionine, ou Violet de Lauth, homologue du bleu de méthylène, a été chaudement recommandée comme colorant de la chromatine par M. Heidenhain. C'est aussi un des colorants spécifiques de la mucine.

Le Bleu de toluidine m'a donné en teinture régressive de superbes colorations, extraordinairement énergiques, de la chromatine, mais (jusqu'à présent) malheureusement accompagnées d'une coloration diffuse du

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SAFRANINE ET AUTRES COLORANTS NUCLÉAIRES 139

cytoplasme. Mann {Zeit. f, wîss. Mik., XI, 4, 1894, p. 489) dit avoir eu de bons résultats en remployant après Téosine, ce qui produit une coloration double, réosiue agissant comme colorant plasmatique.

B. — Colorants progressifs

173. Introduction. — Nous rappelons que la plupart des couleurs tf basiques > donnent une coloration nucléaire plus ou moins précise par voie directe si Ton acidifie les solutions par l'acide acétique (0,5 à 1 p. 100). Nous ne décrirons ici que les procédés qui fournissent des colorations recommandables sous les rapports essentiels de la simplicité des manipulations et la précision et la permanence de la coloration.

174. Le Vert de méthyle du commerce est un chlorure double de zinc et de violet pentaméthyle. Il est préparé actuellement par Inaction du chlorure (ou du nitrate) de méthyle sur la base du violet de méthyle, c'est-à-dire sur le violet de rosaniline méthylée (Benedikt, Chemisiry of Coal-Tar Colours ; Tassart, les Matières Colorantes Artificielles). Le produit commercial est très variable de qualité, souvent impur, et souvent falsifié (Bënedirt).

Cette couleur paraît être aussi connue sous les noms de vert de méthylaniline, vei^t lumière^ « Lichtgrun » (ces deux derniers sont en réalité les noms d'une tout autre couleur). En 1874, lorsqu'elle fut étudiée pour la première fois, parCALBERLA [Morphol, Jahrb., III, 1877, p. 625), elle portail le nom de vert en cristaux. C'est aujourd'hui le plus répandu des verts dits d'aniline, et on le trouve communément dans le commerce passant sous le nom d'autres verts plus coûteux, surtout sous celui de vert d'iode. Il importe de ne pas le confondre avec ce dernier, ni avec le vert d'aldéhyde {vert d'Eusèbe), ou les rosanilines phénylées, le vert de Paris et le vert d'alcali ou véridine. (Voy. le tableau, § 189.)

Calberla, qui fut le premier à recommander ce colorant, en 1877, avait été surtout frappé, dit-il, de son action différente sur les tissus de diverse nature; il avait trouvé que c les noyaux du tissu conjonctif sous-cutané et ceux des vaisseaux et des gaines des nerfs s'y coloraient en i*ose^ tandis que ceux du chorion se coloraient en rougCy et ceux de Tépiderme en diverses nuances de vert bleu et de bleu pur ».

Il est certain que Calberla a dit cela. Cette étrange assertion a été répétée par Griesbach {Zeit. f. wiss. Mik., III, 3, 1886, p. 36o), qui en a fait la base d'une importante déduction théorique.

II est impossible de comprendre sur quoi esl basée cette assertion extraordinaire, car il est certain que jamais le vert de méthyle n'a coloré aucun élément histologique normal ni en rose ni en rouge. On sait depuis longtemps que le produit commercial colore souvent en violet ou en rose la matière amylolde, et en conséquence on l'a proposé comme réactif de la dégénérescence amyloïde (Hesghl, Wiener med. Wochenschr., 2, 1879; puis Corschmann {Virchow^s Arch,, t. LXÏX, 1880, p. 5S6). Il a été suggéré (Fol, Lehrb,, p. 192 ; SouiRE, MethodSj etc., p. 37 ; Paul Mater in liti.) que cette réaction serait due à ce que la couleur employée contiendrait du violet de méthyle comme impureté. Un produit pur ne donne pas cette réaction (Squire, /. c). Et il est certain que le produit commercial contient très souvent cette impureté, comme on peut facilement le comprendred'aprèsson mode de fabrication (voy. aussi Benedikt, /. c). Le vert d'iode du reste est dans le même cas. Il parait donc assez raisonnable de faire les deux suppositions que Calberla avait travaillé avec une couleur qui contenait du violet de méthyle, et qu'il avait eu affaire à des tissus en dégénérescence amyloïde.

Le vert de méthyle fut employé par Balbiani et Hennegut [Ler. sur la gén. d. Vertébrés^ 1879), puis par Frommann, en 1880, pour des recherches sur des structures cellulaires ; et à partir de la recommandation de Strasburger en 1885 {Arch. f. mik.Anat., XXI, p. 476) on peut le considérer comme établi dans la technique en sa vraie qualité de réactif par excellence de la chromatine dans les tissus frais.

Strasburger faisait agir sur des tissus frais une solution d'acide acétique à 1 p. 100 contenant en dissolution un peu de vert de méthyle. Ce procédé se fonde sur ce que le vert de méthyle, qui est par lui-même un agent fixateur suffisant à fixer et à conserver les éléments dans leur forme, du moins pendant quelques heures, l'est à un plus haut degré quand il est combiné avec l'acide acétique. Il a l'avantage de pouvoir être employé sur les tissus frais en combinaison avec d'autres liquides fixateurs ou c indifférents *. Ainsi Garnoy {Biologie cellulaire^ p. 147, 144, 211) l'emploie tantôt, comme Strasburger, avec l'acide acétique seul, tantôt avec une trace d'acide osmique, tantôt ajouté à la solution de Ripart et Petit. On peut aussi l'employer selon la manière usuelle pour colorer des objets soit fixés sur l'heure et lavés à l'eau, soit fixés et conservés selon les méthodes connues.

Il est bon d'employer, pour les tissus frais, une solution un peu forte additionnée de 1 p. 100 d'acide acétique glacial et 0,1 à

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sâfranine et autres colorants kcgléaires 141

1 p. 100 d*acîde osmique. La coloration est instantanée^ et, après lavage, d'une éleclivité incomparable.

La conservation des objets traités de cette manière offre quelques diflicultés, car on ne peut rendre la coloration un peu permanente qu'à force de précautions spéciales. Le mieux est de les montrer dans un milieu aqueux (glycérine, glycérine gélatinée, liqueur de Ripart et Petit), en ayant soin (ïéviter les soltUions salines, 'd'employer toujours un milieu légèrement acide, et d'ajouter sur le bord de la préparation, avant de la fermer, une petite goutte de la solution de vert de méthyle. On peut aussi réussir à conserver ces préparations dans le baume, en employant pour la déshydratation des alcools acidulés par l'acide acétique et chargés d'une quantité suffisante de vert de méthyle, mais ce procédé est assez aléatoire.

M. HEmsNHAiN a trouvé qu'en mordançant par la teinture d'iode la résistance du vert de méthyle à l'alcool (au moins dans la combinaison Ehrlich-Biondi) est sensiblement augmentée. Squirb déclare qu'il en est de même d'un simple lavage à l'eau avant de passer à l'alcool.

Henneguy a trouvé que la couleur se conserve très bien dans le liquide de Brun à la glucose.

On peut aussi employer pour les colorations des solutions alcooliques de vert de méthyle. Ces solutions doivent être acidulées par l'acide acétique.

Le manque de sûreté dans la conservation des colorations met des limites à l'emploi du vert de méthyle ; mais, nous le répétons, ce réactif est d'une importance très grande comme étant le plus précis et le plus infaillible de tous les colorants de la chromatine à Vétat frais; pour les préparations temporaires il est certainement sans rival.

Employé sur des tissus frais ou seulement légèrement fixés, le vert de méthyle est le réactif colorant par excellence de la chromatine. Car au sein du noyau il ne colore absolument rien que les chromosomes; il ne colore ni les nucléoles plasmatiques, ni le caryoplasme, ni le fuseau. Les recherches minutieuses de contrôle de Carnoy ont mis ces faits hors de doute. En dehors du noyau, le vert de mélhyle peut colorer diverses substances, telles que les enclaves du protoplasma cellulaire, le protoplasma lui-même, certaines membranes et certaines sécrétions, telles que la soie.

175. Vert d'iode (Hofmann's Orûn). — Cette substance a été introduite dans la techuique histologique par Griesbach (Zool. Anzeiger, \, 1882, p. 406). Griesbach pense que le vert d'iode est plus utile que toutes

les autres anilines. Les autres histologistes ne se sont pas rangés à son avis, et ce colorant est aujourd'hui entièrement démodé. Du reste le vert d'iode ne se fabrique plus pour l'industrie de la teinture. On peut cependant s'en procurer chez Grûbler.

178. Brun Bismarck (Vésuvine, Manchester Bro^wn, la Phénicienne). — Ilislologiquement, cette couleur présente bien des points de ressemblance avec les deux précédentes. C'est un bon colorant électif des noyaux, et pouvant être employé aussi bien pour des tissus frais que pour ceux qui ont été conservés par les méthodes ordinaires. Les objets traités par l'acide chromique s'y colorent, mais moins bien que d*autres.

Le brun Bismarck ne se dissout pas très facilement dans l'eau. On peut le faire bouillir dans Teau, et filtrer après un jour ou deux (Wëigert, Arch. f. mik. Anat., XV, 1878, p. 258). On peut additionner les solutions aqueuses d'acide acétique et d'acide osmique. Mayzel {Arch, f. mik. AnaL, XVIII, 1880, p. 237 et 250) fait dissoudre la couleur directement dans l'acide acétique ; en ce cas, les colorations ne sont pas permanentes.

Paul Mayër emploie aussi une solution saturée de brun Bismarck dans l'alcool à 70 degrés.

Il y a quelquefois avantage à employer une solution dans de la glycérine allongée de 50 à 60 p. 100 d'eau. Les solutions faites à Teau demandent à êlre souvent filtrées. On a recommandé d'y ajouter de l'acide phénique (Journ. Roy, Mie, Soc, 1886, p. 908).

C'est un colorant énergique. Des préparations alcooliques ou chromiques peuvent se colorer en quelques instants dans les solutions concentrées, et en quelques minutes dans des solutions étendus. On peut laver à l'eau et monter à la glycérine ; ou bien, passer par les alcools, l'essence de girofle et le baume.

Celte couleur a deux qualités qui contribuent à la rendre extrêmement utile en bien des cas : elle produit rarement des colorations excessives, et, la couleur ne se laissant pas trop facilement extraire par l'alcool, il est très facile de faire des préparations permanentes au baume.

Nous rappelons qu'elle sert pour les t colorations vitales ».

179. Violet de Méthyle (Violet de Paris). — Le procédé suivant a été recommandé par Orth (Journ, Boy, Mie. Soc, 1881, p. 137). On colore dans une solution de 1 partie de la couleur dans 300 parties d'acide acétique, on ne lave pas, mais on égoutte et on monte dans une solution de 2 parties d'acétate de potasse dans 1 partie d'eau. Les préparations ne se conserveront guère au delà d'un an.

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SÂFRANINE ET AUTRES COLORANTS NUCLÉAIRES 143

Le procédé suivant parait devoir être plus utile. Grasbr (cité d*après ScuiEFFERDECKER, qui le recommande, dans Zeit. f. wiss. Mik.^ V, 3, 1888, p. 378) procède comme suit. Des coupes sont colorées pendant douze à vingtquatre heures dans une solution (il n*est pas dit si c'est dans Teau ou dans Talcool) si diluée qu'au bout de ce temps elles en ont absorbé toute la couleur. Décoloration dans Talcool acidifié suivi d*alcool pur. D'après ScHiEFFERDECKERla différenciation des figures karyokinétiques serait encore plus belle qu'avec la safranine.

La matière amyloïde parait rouge dans les préparations colorées au violet de méthyle. D'après les intéressantes expériences de Capparelli (Archivio per le Soi. mediche, III, 21, p. 1), ce serait là un phénomène d'ordre physique (la matière amyloïde aurait la propriété d'arrêter les rayons violets tout en laissant passer les rayons rouges).

Voyez aussi Violet B, au chapitre suivant.

A. — - BLEU DE MÉTHYLÈNE

180. Bl6u de méthylène. Introduction. — Cette couleur est sous bien des rapports un réactif d'une grande importance. Nous avons déjà dit qu'elle donne de bonnes colorations nucléaires par la méthode régressive. Son importance comme colorant des microbes dans les tissus est connue de tous les pathologistes. On s'en sert comme colorant spécifique des nerfs à myéline du système nerveux central. C'est aussi un réactif spécifique pour certaines cellules à granules {Plasmazellen). C'est une des couleurs les mieux tolérées par les cellules vivantes , et partant un des meilleurs colorants c vitaux ». Enfin il sert à fournir des colorations spéciales de tissu nerveux, de ciments intercellulaires, d'espaces lymphatiques et autres objets de ce genre qui sont essentiellement identiques à celles que fournissent les imprégnations à l'or ou à l'argent les mieux réussies ; elles les valent comme résultats, et elles ont l'avantage de se laisser produire avec plus de facilité et de sûreté. C'est ce dernier emploi du bleu de méthylène qui va surtout nous occuper maintenant.

Il est très important de travailler avec une couleur parfaitement pure, et pour cela il est urgent de s'adresser à Grûbler ou à l'un des fournisseurs cités au numéro 99. Apatuy, dont nous allons décrire les procédés d'imprégnation, n'a trouvé qu'une seule marque qui donne exactement les résultats qu'il décrit ; c^est la marque « medicinisches Methylenblau^ chemisch rein und chlorzinkfrei »> de E. Merck, à Darmstadt.

BLEU DE MÉTHYLÈNE ET AUTRES COLORANTS PLASMATIQUES i45

181. Coloration « vitale » d'organismes entiers. - De oetits orgaa.smes aquatiques facilement perméables peuvent être colorés pendant a vie en additionnant Teau dans laquelle ils vivent d^un peu de la couleur (assez pour donner à l'eau une teinte bleue perceptible). Après avoir suffisamment attendu, quelques heures ou plusieurs jours, on trouve à l'examen que certains tissus des sujets en l'expérience se sont imbibés plus ou moins de couleur, tandis que d'autres sont demeurés incolores. Si maintenant on remet les animaux dans l'eau colorée et qu'on attende encore on trouvera après un laps de temps suffisant, que d'autres groupes de tissus se sont imbibes à leur tour de la couleur. On pourrait bien s'imaSr en conséquence que si l'on attendait encore plus longtemps il arriverait à la fin un moment où tous les tissus des animaux se montreraient chargés de la couleur. Or il n en est rien. On trouve au contraire qu'un tissu quelconaue ne conserve la couleur qui l'a imbibé que pendant fort peu de temps après qu il a atteint le degré maximum de coloration dont il est susceptible -une fois ce point atteint, il commence à dégorger la couleur encore plus vhe quil ne la absorbée. L'animal peut même, comme je l'ai observé, aorès s être colore dans la plupart de ses tissus, se décolorer entièrement, touiours dans 1 eau chargée de la couleur, et cela sans avoir apparemment souffert en aucune façon. Il s'ensuit évidemment que ces « colorations vitales » ne sauraient prétendre au titre de teintures véritables, mais que ce sont de simples imbibitions des tissus par la couleur. Le lecteur voudra bien revoir ICI ce qui a été dit à ce sujet au numéro 97.

Si dans ces conditions on ne peut guère espérer d'obtenir une coloration générale de tous les tissus d'un organisme, on peut cependant obtenir une coloration hmitee a certains de ces tissus, et cela de deux manières On v arrive par la méthode progressive. Si le tissu qu'on désire observer est de ceux qui se colorent de bonne heure, on interrompt l'immersion aussitôt que ce tissu a atteint une coloration suffisante et avant que les autres ne se soient imprégnés au point de gêner l'observation. Et l'on y arrivé nar la méthode régressive. Si le tissu à observer est de ceux qui se colorent tar diyement,on attend pour l'examiner jusqu'à ce que les éléments qui se sont colores en premier lieu aient dépassé leur point de saturation et se soient deja dégorges de leur couleur, pendant que les éléments à observer montrent encore une coloration suffisante. La couleur peut être fixée à l'une ou rautre de ces étapes par des procédés que nous donnons plus loin (Conservation). ^

La coloration qu'on obtient par ce procédé d'immersion totale d'un ani mal vivant est limitée en général à des granulations cytoplasmiques qui se colorent quelquefois très vivement (voyez encore au n^ 97) L'ordre dans lequel les tissus se montrent colorés ne peut pas être prévu -il parait dépendre des divers degrés de perméabilité des tissus. Les épithéliums surtout les épithéliums glandulaires, se colorent en général très vite* puis les cellules lymphoïdes, les muscles, etc. Le tissu nerveux se colore 'tard ■ je n'ai jamais pu le colorer chez un animal parfaitement intègre. On comprendra sans peine qu*un procédé pareil ne saurait être d'une fort grande utilité dans les recherches anatomiques. J'ai surtout tenu à décrire la marche de la soi-disant a coloration vitale » chez les animaux entiers parce qu'elle permet de mieux comprendre la marche à suivre dans les véritables imprégnations ou teintures.

ANAT. MICROSC. ^a

La proportion de couleur à ajouter à l'eau pources expériences varie naturellement selon les objets. On pourra souvent se laisser guider par la teinte; un bleu assez sensible ne nuira guère, même à des organismes délicats. Zoja (Rendic. R. Ist. Lombardo, XXV, 1892; Zeii.f, wiss. 3/t/j.,lX, 2, 1892, p. 208) a trouvé qu'une proportion de 1 p. 20000 ou 10000 d'eau est celle qu'il laut pour Hydra, Je pense que le plus souvent 1 p. 100000 sera bien assez.

182. Coloration < vitale » de tissus nerveux. — Le principe de ces colorations est dû à EriRUcu {Abh. k, Akad, Wiss. Berlin, 25 Feb. 1885 ; Nature, 1885, p. 547). — En injectant des animaux vivants avec des solutions de bleu de méthylène, Ehrlich avait obtenu <les colorations de cylindres de Taxe de nerfs périphériques ; ces éléments appartenaient toujours à des nerfs sensitifs, les nerfs moteurs ne contenant aucun élément qui montrât cette réaction. (On a trouvé depuis (Arnstetn) que les nerfs moteurs se colorent bien aussi, mais plus tardivement). L'état de vitalité des tissus ainsi colorés est un point en litige.

On a cru pendant longtemps que ces colorations ne pouvaient pas se réaliser sur des tissus morts. Cependant Dogiel {Arch, f, mik. Anat., XXXV, 1890, p. 305 et seq.) a pu imprégner des nerfs sur des membres de Grenouille jusqu'à trois et même huit jours après que ces membres avaient été séparés de Tanimal. Il en a conclu, à la vérité, que cette expérience montre que les nerfs vivaient encore au moment de la coloration. Mais il paraît plus naturel d'en conclure, avec Apatdy {Zeit. f. wiss. Mik., IX, 1, 1892, p. 15 et suiv.) que la coloration peut se produire après la mort.

Apatuy a fait une série d'expériences destinées à élucider ce point. Voici ses résultats. Il n'est pas nécessaire que le tissu soit vivant, mais il faut qu'il soit frais; aucun élément ne doit en avoir été extrait par action chimique ; et son état normal ne doit pas avoir été essentiellement changé par des moyens physiques. Par exemple, le tissu ne doit pas avoir été traité parla glycérine, même diluée, ni par l'alcool ; un traitement de peu de durée par la solution physiologique de sel n'est pas très nuisible ; le tissu ne doit pas avoir été coagulé par la chaleur.

Il est à peine nécessaire de rappeler que, d'après les conclusions du numéro 97, la coloration une fois établie doit nécessairement intéresser seulement des éléments qui ne vivent plus.

On admet généralement que Id. présence de l'oxygène e&i nécessaire pour la réalisation de la coloration bleue des éléments nerveux. En conséquence, après avoir traité l'organe par le. bleu de méthylène par injection ou immersion, on a coutume de le réséquer et le laisser pen-

dant quelque temps exposé à Tair. Et eflectivement il se trouve le plus souvent que les tissus ainsi traités ne bleuissent que quelque temps après avoir été ainsi exposés à Tair. Apatoy a aussi examiné ce point et trouve {L c, p. 25) que cette pratique est souvent bonne, mais que la croyance sur laquelle elle repose est erronée. Voici, selon, Apatuy, la véritable explication de ce qui se passe.

La coloration des nerfs est une coloration régressive. Il a été expliqué plus haut que presque aussitôt qu'un élément a atteint le degré maximum de coloration dont il est susceptible au contact d'une solution de bleu de méthylène, il commence à céder de nouveau sa couleur au liquide qui le baigne. Or plus est considérale le volume de ce liquide et plus sera rapide ce processus de décoloration. Est-il d'une rapidité très grande, la couleur sera vite enlevée des éléments nerveux que seuls on désire avoir colorés, aussi bien que des éléments à coloration plus précoce que Ton désire décolorer pour avoir la coloration spécifique des éléments nerveux seulement. Il est donc avantageux que cette décoloration obligée se fasse dans un volume de liquide aussi petit que possible. Il existe bien une autre considération qui justifie la pratique en question. C'est que par l'exposition à l'air les préparations s'assimilent des traces d'ammoniaque. Et Apàthy a établi par des expériences que ceci est un facteur important dans la précision de la coloration. Il n'admet pas que l'oxygène y joue un rôle quelconque.

183. Coloration par injection et par immersion. — La pratique ancienne pour la coloration de nerfs était toujours d'introduire la solution colorante par injection dans le système vasculairc ou dans la cavité du corps d'un animal vivant, d'attendre un temps suffisant pour qu'elle puisse agir sur les tissus, puis d'enlever l'organe à étudier pour la préparation ultérieure. On croyait communément que le procédé par injection était essentiel à la production de la coloration. On sait maintenant que cette condition n'est nullement essentielle, et que la réaction s'obtient habituellement tout aussi bien sur des organes simplement enlevés de l'animal et soumis à un bain de la matière colorante de la manière usuelle. Il paraîtrait cependant que pour de certains objets le procédé par injection serait préférable sinon nécessaire. C'est ce qu'a trouvé Burger pour les Némertiens {Mitth. ZooL Stat. Neapel, X, 1891, p. 206).

184. Les solutions Remployer. — Les solutions pour injection se font d'habitude dans de la solution de sel de cuisine dans l'eau à

0,75. p. 100 OU moins; les solutions pour coloration par immersion se font ou bien dans la solution saline ou bien dans un liquide € indifférent», ou enfin dans Teau pure. Les premiers travailleurs employaient des solutions plutôt concentrées de la couleur. Ainsi Arnstein {Anat. Anz., 1887, p. 125) injectait dans la vena cutanea magna des Grenouilles 1 ce. de solution saturée, et enlevait Torgane à étudier après une heure. Biedermann [Sitzb. d. k, Akad, Wiss, Wien; Math. Nat. Classe, 1888, p. 8) injectait dans le thorax des Écrevisses 0,5 à 1 ce. d'une solution presque saturée dans de la solution de sel à 0,6 p. 100, et laissait les animaux de deux à quatre heures avant de les sacrifier. S. Mayer {Zeit, f, wiss. Mik., VI, 4, 1889, p. 423) employait une concentration de 1/300 ou 1/400 dans de la solution saline à 0,5 p. 100. Une pareille solution peut être introduite dans l'organisme soit par injection au moyen d'une seringue, soit par auto-injection au moyen du cœur de l'animal. Les Lapins supportent bien cette opération si l'on a soin de pratiquer en même temps la respiration artificielle.

Les solutions de Retzius sont d'une concentration semblable. Mais la tendance des travailleurs plus récents est dans la direction de concentrations plus faibles. Apatuy (Zeit. f, wiss. Mik., IX, 1, 1892, p. 25, 26, et seq.) trouve qu'il est non seulement inutile, mais même désavantageux de prendre des concentrations supérieures à 1/1 000.

Les solutions à employer pour la coloration par immersion sont ne général plus faibles que celles que l'on emploie pour l'injection. Dogiel {Arch. f. mik. Anat., XXXV, 1890, p. 305; et d'autres travaux plus récents, comme op. cit., XLIV, 1894, p. 18) place des portions de tissu dans quelques gouttes d'humeur aqueuse ou vitreuse, ajoute 2 ou 3 gouttes de solution de la couleur à 1/16® ou 1/15® p. 100 dans de la solution physiologique de sel, et laisse la préparation exposée à l'air. La coloration commence, dans des portions de tissu mince, au bout de cinq à dix minutes, et atteint son maximum dans quinze à vingt minutes. Pour des objets plus épais, — rétine par exemple, — il faut quelquefois plusieurs heures, et en ce cas il faut tenir la préparation humide en l'humectant alternativement de temps à autre avec une goutte du liquide indifférent et une goutte de la teinture. La coloration sera activée par l'emploi (en hiver) d'une étuve chauffée à 30'^35'' C. Rouget {Comptes rend., 1893, n** 21, p. 802-4) a trouvé qu'une modification utile du procédé de Dogiel consiste à employer une concentration de 0,03 p. 100 dans de la solution de sel à 0,6 p. 100 (muscles de Batraciens). Allen [Quart. Journ. Mie. Soi., 1894, p. 461, 483) prend pour des embryons de Homards une solution de

BLEU DE 3IÉTIiYLÈNE ET ACTRES COLORANTS PLASMATIQUES 149

i p. 1000 (dans de la solution saline) qu'il dilue encore de 15 à 20 volumes d'eau de mer.

185. Méthodes d'Apëithy. — Gomme exemple de ces opérations nous ajoutons une description abrégée de la marche recommandée par Apathy {Zett. f, wiss. Mik., IX, 1, 1892, p. 15) pour les Hirudinées. On met à nu une portion de la chaîne ganglionnaire. Si on le préfère, on peut la réséquer, mais il vaut mieux ne pas en éloigner le sinus ventral et le tissu pigmenté qui Fentoure avant que la coloration et la fixation niaient été achevées. Cependant, si Ton désire avoir une coloration de cellules ganglionnaires en même temps que des fibres nerveuses, il faut couper les nerfs latéraux en même temps que les cordons connectifs, dans le voisinage d'un ganglion. La préparation est traitée alors par la solution colorante. Celle-ci se compose, — pour la démonstration surtout des fibres chez Hirudo et Pontobdella — ou bien d'une solution à 1 p. 1000 dans de la solution saline de 0, 5 à 0,75 p. 100 qu'on laisse agir pendant dix minutes; ou d'une solution à 1/10000, qu'on laisse agir pendant une heure ou une heure et demie ; ou d'une solution à 1/100000 qu'on laisse agir pendant trois heures. (Ces chiffres doivent être doublés pour LumbricuSy triples pour i4s^act^5 et UniOj et quadruplés pour les nerfs à myéline des Vertébrés. Pour la démonstration des cellules ganglionnaires, ils doivent être triplés (les cordons connectifs et les nerfs latéraux ayant été coupés comme nous l'avons dit).

Après coloration, les préparations faites à la solution de 1/1000 sont lavées pendant une heure dans de la solution saline; celles faites à la solution de 1/10000 pendant un quart d'heure ; celles faites à la solution de 1/100000 ne demanderont pas de lavage.

Après lavage, on les traite par l'un des liquides fixateurs et différentiateurs décrits au numéro suivant.

Ceci se fait en les inondant du liquide et en les y laissant pendant au moins une heure sa7is les remuer dans le liquide, et au mieux à l'obscurité. Le traitement ultérieur est également décrit au numéro suivant.

Les liquides fixateurs en question contiennent de l'ammoniaque. Le but de cette addition est d'aider à la différentiation de la couleur en produisant une différenciation régressive artificielle. L'ammoniaque agit en décolorant certains éléments plus rapidement que d'autres.

Dans l'objet que nous étudions ce sont, d'après Apathy, les parties protoplasmiques des fibres nerveuses, puis leur « substance interfibrillaire > et c périfibrillaire » qui se décolorent en premier lieu, les « fibrilles primitives > retenant encore fortement la couleur. D'après

Apathy, la coloration que Ton obtient ainsi serait une véritable teinture de « fibrilles primitives », et non une simple imprégnation. Les c fibrilles primitives 3 se montrent nettement teintées d'un bleu violet, sans aucun précipité granuleux, la substance « interfibrillaire » et c périfibrillaire », et les noyaux, se montrant incolores ou à peu près. Les méthodes usuelles au contraire donnent une réaction inverse, les « fibrilles primitives » demeurant incolores, pendant que la substance « interfibrillaire > et le protoplasme des fibres nerveuses sont imprégnés d'un précipité finement granuleux d'un noir verdâtre ou violet, et que les noyaux se montrent en général colorés.

186. Fixation et conservation. — Nous avons déjà expliqué que les colorations obtenues par ces procédés ne se conservent pas au delà de quelques heures, souvent pas au delà de quelques minutes, si Ton ne met en œuvre des précautions spéciales pour les conserver. DoGiEL {Arch. f. mik. Anat., XXXIII, 4, 1889, p. 440), suivant Arnstein {Anat. Anz.j 1887, p. 581), procède comme suit. Après coloration, les préparations sont mises, pour fixer la couleur, dans une solution saturée de picrate d'ammoniaque. On les y laisse une demiheure ou plus, puis on les lave dans une nouvelle quantité de la solution et on les porte pour l'étude dans de la glycérine diluée, ou bien on les monte définitivement dans de la glycérine saturée de picrate. Plus récemment {Zeit, f, wiss, Mik., YIII, 1, 1891, p. 15) cet auteur a trouvé préférable de prolonger le bain de picrate jusqu'à dix-huit ou vingt-quatre heures, et de monter dans de la glycérine chimiquement pure et libre d'acide, ou bien {Arch. f. mik. Anat., 44, 1894, p. 16) dans de la glycérine allongée d'un volume de la solution de picrate. Ces procédés ont un inconvénient ; c'est'que le picrate d'ammoniaque exerce une action macérante très nuisible sur certains tissus. On peut éviter cela en ajoutant au bain de fixation 1 à 2 p. 100 de solution d'acide osmique à 1 p. 100. (Si l'on désire durcir les tissus pour en faire des coupes, il convient de quadrupler la dose de solution osmique.)

S. Mayer {Zeit. f, wiss. Mik., VI, 4, 1883, p. 422) préférait l'emploi d'un mélange à parties égales de glycérine et de solution saturée de picrate d'ammoniaque, mélange qui servait à la fois à fixer la couleur et à monter les préparations. C'était là en principe aussi la méthode de Retzius {Intern, Monatss. f. Anat. u. Phys,^ VII, 8, 1890). DoGiEL, à la suite d'expériences comparatives, se refuse à admettre que ce procédé soit un perfectionnement.

D'autres travailleurs ont employé une solution saturée d'iode dans

riodure de potassium (Arnstein), ou bien le picro-carmin (ainsi Feist, Arch. A Anai. u. Entw,, 1890, p. 116). Le picro-carmin aurait l'avantage de conserver la couleur bleu pur de la teinture, si on ne le laisse pas agir trop longtemps, et si Ton monte ensuite dans la glycérine pure.

Lavdowsky a employé Tacide picrique. Dogiel a étudié ce procédé et l'a rejeté.

Apatuy {ZeiL f. wiss. Mik,^ IX, 1, 1892, p. 30) a trouvé, comme nous Tavonsdéjà dit que la présence d*ammoniaque libre est un facteur important dans la différenciation de la coloration. Il met ses préparations (après lavage ou non, selon ce qui a été dit au numéro précédent) soit dans une solution saturée de picrate d'ammoniaque libre d'acide picrique et additionnée de 5 gouttes d ammoniaque concentrée pour 100 ce. ; ou bien, ce qui vaut en général mieux, dans une solution à 1 ou 2 p. 100 de carbonate neutre d'ammoniaque, fraîchement préparée et saturée de picrate. 11 les laisse dans l'un ou l'autre de ces liquides pendant au moins une heure^ et au mieux à l'obscurité. 11 les met ensuite dans une petite quantité de solution saturée de picrate dans de la glycérine à 50 p. 100 et les y laisse jusqu'à ce qu'elles en soient parfaitement pénétrées. Puis il les met dans une solution saturée de picrate dans un mélange de glycérine à 50 p. 100, 2 parties, solution de sucre saturée à froid, 1 partie, et solution pareille de gomme arabique, 1 partie. Après pénétration par ce mélange il les monte définitivement dans le milieu suivant [L c, p. 37).

Gomme arabique 50 grammes.

Sucre de caune 50 —

Eau distillée 50 —

(Faire dissoudre au bain-marie et ajouter S centigrammes de thymol.) Ce sirop durcit très vite et devient aussi dur que le baume, de sorte qu'il n'est pas nécessaire de luter les préparations. On peut aussi se servir du médium de Farrant (mais en ce cas sans addition d'acide arsénieux). On ne doit en aucun cas ajouter ni picrate d'ammoniaque ni bleu de méthylène au milieu conservateur.

Aucune de ces méthodes n'est parfaitement satisfaisante. La plupart n'en conservent pas la coloration dans son ton naturel de bleu, mais la font virer à un gris variant du brunâtre au noir verdâtre. Les préparations ne se conservent guère, même en cet état, au delà de quelques mois ; et Ton est obligé de renoncer au montage au baume. Ces préparations sont particulièrement sensibles à l'action de la lumière. La vive lumière concentrée sur les préparations par le condensateur pendant l'observation leur nuit beaucoup. Et Apathy a

remarqué que l'e'clairage artificiel est plus nuisible que la lumière du jour, ce qu'il attribue en partie à Tabondance des rayons jaunes, et en partie à la chaleur considérable.

187. Méthodes pour les coupes. — Les procédés décrits jusqu'ici ne donnent pas une fixation de la couleur suffisante pour permettre remploi des méthodes usuelles d'inclusion. Fëist {Arch, /. Anat. u. Entw., 1890, p. 116; Zeit. f. wiss. Mik., VII, 2, 1890, p. 321) dit qu'une forte solution de chlorure de platine donne une fixation qui supporte Tinclusion soit dans la celloïdine, soit dans la paraffine. Mais le précipité de couleur fourni par ce réactif est de nature granuleuse, et les préparations ne sont pas très satisfaisantes. Le même auteur a aussi trouvé qu'on peut mettre en œuvre l'inclusion à la gomme de Joliet.

La Méthode'dfi Parker {ZooL Anz.y 403, 1892, p. 375) est un perfectionnement important. La couleur est fixée (sous forme d'un précipité violet très finement granuleux) par (1) une solution saturée de sublimé dans Teau. On déshydrate alors les objets dans (2) une solution de 1 gramme de sublimé dans 5 ce. de mélhylal (le méthylal pur décolorerait plus ou moins).

On éloigne ensuite le méthylal par un mélange (3) de deux parties de xylol, une partie de méthylal pur, et une partie du mélange numéro 2. Après quelque temps on passe à (4) une quantité considérable de xylol pur. Les préparations doivent y rester jusqu'à ce que tout le méthylal et tout le sublimé en aient été complètement éloignés. 11 faut pour cela quatre à cinq jours, car le sublimé est très peu soluble dans le xylol. On peut maintenant monter au baume; ou, si l'on désire faire des coupes, on passe au bain de paraffine et Ton fait l'inclusion de la manière usuelle.

Les coupes doivent être collées sur porte-objet par le collodion de Schàllibaum et non par l'albumine de Mayer, car celle-ci les décolore. Les préparations se conservent pendant quelques semaines, mais au bout d'un mois les détails fins auront soufi'ert.

La durée des opérations demandée pour un ganglion de la chaîne ventrale d'une Écrevisse est comme suit : pour 1 , dix minutes ; 2, quinze minutes ; 3, dix minutes ; 4, quatre ou cinq jours.

-La Méthode de Bethe {Arch, f. mik, Anat., XLIV, 4, 1894, p. 585) est comme suit. On fait une solution de

Molybdate d'ammoniaque 1 gramme.

Eau distillée 10 —

Peroxyde d'hydrogène I —

BLEU DE MÉTHYLÈNE ET AUTRES COLORANTS PLASMATIQUES lo3

(En ajoutant le peroxyde, coloration jaune.) On ajoute 1 goutte d'acide chlorhydrique officinal (précipité blanc d'acide molybdique soluble après agitation). Après coloration et rinçage avec de la solution saline, on met les pièces dans la solution molybdique. Elle doit être fraîche, c'est-à-dire n'avoir en tout cas pas plus de huit jours : il est bon avant de s'en servir de la refroidir à 0°. On y laisse les pièces deux à trois heures si elles sont petites, quatre à cinq heures si elles sont grandes (1 centimètre). On lave pendant une demi-heure à deux heures dans de l'eau, on déshydrate à l'alcool (au mieux refroidi àO*^), on éclaircit à l'essence de girofle ou (mieux) au xylol. On fait l'inclusion à la paraffine ou au collodion de la manière habituelle.

La formule ci-dessus est pour les tissus des Vertébrés. Pour les Invertébrés, Bethe conseille 1 gramme de molybdate, 10 ce. d'eau, et 0,5 ce. de peroxyde.

188. Méthodes pour imprégnations (épithéliums, espaces lymphatiq[ues, etc.). — Voici les procédés de Dogiel [Arch, f. mik, Anat., XXXIII, 4, 1889, p. 440). Des portions convenables de tissus (des membranes minces, si possible) sont mises à l'état frais dans une solution à 4 p. 100 de bleu de méthylène dans de la solution physiologique de sel. Après quelques minutes on les met dans une solution saturée de picrate d'ammoniaque, on les y laisse pendant une demi-heure ou plus, on lave dans une nouvelle quantité de solution de picrate, et on les porte pour l'étude dans de la glycérine diluée.

Si l'on désire démontrer les contours de cellules endothéliales seulement, le bain de teinture doit être abrégé, et ne pas durer plus de dix minutes en général. Si au contraire on désiré obtenir en outre l'imprégnation de la substance fondamentale des tissus de manière à avoir une image négative des fins canaux lymphatiques ou autres espaces intercellulaires, il faut colorer pendant quinze à trente minutes, et il sera préférable d'éloigner le revêtement endothélial des tissus avant de les mettre dans le bain de teinture.

Fixation de la couleur, et conservation, comme au numéro 186. Les résultats sont pratiquement identiques, sauf la couleur, à ceux d'une imprégnation négative au nitrate d'argent.

Méthodes de S. Mayer {Zeit. f. wiss, Mik., VI, 4, 1889, p. 422). Les expériences de Mayer, faites en même temps que celles de Dogiel, mais indépendamment de celles-ci, se rapportent à des objets semblables, et donnent des résultats pareils. Mayer colore pendant

dix minutes dans une solution à 1/300 ou 400 de bleu de méthylène dans de la solution de sel à 0,5 p. 100, lave à la solution de sel et monte dans la solution glycérinée de picrate d'ammoniaque citée numéro 186. 11 trouve que par ce procédé on peut produire tous les effets essentiels d'une imprégnation au nitrate d'argent. Les images sont ou bien positives ou bien négatives. Dans les épithéliums stratifiés et dans les endothéliums (par exemple dans les canaux testiculaires du rat, dans le système vasculaire, dans le muscle lisse), les ciments intercellulaires sont imprégnés. Dans la cornée, la substance fondamentale est imprégnée, et Ton obtient des images négatives des cellules fixes. De même on obtient quelquefois des images négatives des terminaisons nerveuses intra-sarcolemmaires des muscles striés des Grenouilles et des rats. Mais on obtient également quelquefois, comme cela arrive aussi pour le nitrate d'argent, des images positives des éléments de la cornée. Si Ton a procédé par injection de la couleur dans le système vasculaire, ce sont les images positives qui sont les plus abondantes ; tandis que si Ton a coloré par immersion, ce sont les images négatives qui sont les plus fréquentes. Dans les nerfs à myéline, on obtient des images frappantes des figures cruciformes des étranglements de Ranvier.

En somme, presque toutes les images qu'on obtient avec le chlorure d'or ou avec le nitrate d'argent peuvent être obtenues au moyen du bleu de méthylène, et cela avec beaucoup plus de facilité et de sûreté.

Pour les autres emplois spéciaux du bleu de méthylène (organes des sens, rétine et terminaisons nerveuses sensitives et motrices, système nerveux central), voir aux chapitres spéciaux de la Deuxième Partie.

B. — Autres colorants plasmatiques

189. Fuchsine acide (Sœurefuchsin, Fuchsin S., Rubin S., Sseurezoïbin, Magenta acide, Magenta S. ; la dénomination de € Patentsàure Rubin > attribuée à cette couleur par Kultschitzky {Anat, Anz.y VIII, 1893, p. 357) est une erreur ; le nom de la couleur dont s'est servi Kultschitzky est « Rubin S., rein pat. », de la Actieii- Gesellschatf, f. Aniliiifabrication à Berlin; \oyez Zeit, f, wiss, mik,^ X, 2, 1893, et Anat. Ergeb., III, 1893, p. 18-19).

Cette matière colorante est le sel de sodium de la rosaniline disulfoconjuguée, obtenu par le traitement de la rosaniline par l'acide sulfurique concentré. C'est donc une couleur « acide », le principe

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BLEU DE MÉTHYLÈNE ET AUTRES COLORANTS PLASMATIQUES loo

colorant de ce sel étant représenté par un corps acide. Tandis que dans la fuchsine ordinaire ou fuchsine c basique », qui est le chlorhydrate de la rosaniline considérée comme base, c'est cette base ellemême qui est le principe colorant, ce qui fait que cette couleur est dite « basique ».

Cette couleur est très importante, étant un des meilleurs colorants plasmatiques, sinon tout à fait le meilleur, de toutes les anilines. Sa dissolution dans Teau (elle est peu soluble dans l'alcool) colore rapidement et énergiquement l'élément plastinien du cytoplasme et du caryoplasme, tout en respectant la chromatine. Cette électivité, qui peut être très précise, ne s'obtient cependant pas toujours sans l'observation de certaines précautions ; un certain degré d'acidité de la solution est, paraît-il, souvent une condition nécessaire. (Voyez sur ce sujet les mémoires de Martin Heidenhain, Ueber Kern und Protoplasma, 1892, et Neue Untersuchungen, etc., dans Arch. f. mik. Anal,, 43, 3, 1894). La coloration résiste fortement au lavage par l'alcool.

La fuchsine acide sert surtout comme colorant plasmatique qu'on fait agir après un colorant nucléaire. Pour cet emploi, une solution à 0,5 p. 100 convient très bien. On la laisse agir seulement quelques minutes, tout en surveillant la marche de la coloration. Elle entre comme ingrédient dans plusieurs mélanges de couleurs très employés, comme le mélange Ehrlich-Biondi-IIeidenhain. Voyez pour ces procédés aux Colorations combinées. Elle donne aussi des colorations spécifiques de fibres nerveuses, nous en parlons dans la Deuxième Partie.

190. Rouge Congo (Gongoroth; ne pas confondre avec d'autres CoDgos, comme le jaune Congo, Congo brillant, etc. Introduit dans la technique par Griesbacu, Zeit. f, wiss. Mik., III, 3, 1886, p. 379). Couleur azoïque, acide. Sa solution aqueuse a une réaction neutre ou alcaline. C'est une des couleurs les mieux tolérées par les cellules vivantes, voyez n° 97. La solution, de même que la coloration qu'elle donne aux tissus, sont naturellement rouges ; mais la couleur dans les deux cas passe à un beau bleu en présence de la moindre trace d'acide (réaction servant à démontrer la présence d'acides libres dans les tissus, voyez les travaux cités par Griesbach, loc. cil,).

Je m'en suis servi comme colorant plasmatique avant un colorant nucléaire bleu, de la même manière que la fuchsine acide, et j'ai eu de très belles préparations. Malheureusement la couleur ne s'est pas consei-vée.

Pour les colorations spécifiques de fibres nerveuses que donne cette couleur, voir à la Deuxième Partie.