MAMMIFÈRES

556. Lapin. Recherche des ovules. — Nous prendrons comme type l'embryon du Lapin. Pour observer les premiers développements du Lapin, il faut rechercher les ovules dans les trompes, un certain nombre d'heures après l'accouplement. La déhiscence des follicules se fait environ dix heures après le premier coït.

Une même Lapine peut servir à faire deux observations différentes à quelques heures ou à quelques jours d'intervalle. Pour cela, on pratique sur la ligne médiane ou sur le côté de Tabdomen une incision longitudinale de 8 à 10 centimètres ; tandis qu'un aide empêche les intestins de sortir, on place une première ligature à la base de la corne utérine, au-dessus du col, puis on comprend dans une seconde ligature tout le mésométrium et le mésovarium. On détache alors, avec des ciseaux, Tovaire, la trompe et la corne utérine. Il n'y a plus qu'à refermer Tabdomen par quelques points de suture comprenant d'abord la couche musculaire, puis la peau. Les Lapines supportent très bien cette opération, qui n'entrave nullement le développement des ovules du côté opposé. Lorsqu'on veut observer ces derniers, on sacrifie l'animal, à moins qu'on ne lui fasse subir une seconde laparotomie si on désire le garder pour des vivisections ultérieures.

La trompe et la corne utérine étant extraites de l'animal, il faut les laisser refroidir pendant quelque temps et attendre que les contractions musculaires aient cessé. Puis, à l'aide de petits ciseaux ou d'un bon scalpel, on débarrasse soigneusement toutes les circonvolutions du conduit génital de leur enveloppe péritonéale.

Si les ovules sont encore contenus dans la trompe, c'est-à-dire jusqu'à la fin du troisième jour, on étend la trompe sur une longue lame de verre et on l'ouvre longitudinalement avec une paire de ciseaux fins et coupant bien. A l'aide d'aiguilles et de bruxelles on étend la muqueuse tubaire afin d'en effacer autant que possible les plis, et on examine l'organe avec une forte loupe, ou à l'aide d'un microscope à un très faible grossissement. Lorsqu'on a trouvé les ovules, on les enlève avec la pointe d'un scalpel, avec une aiguille à cataracte, ou à Taide d'une petite pipette, après avoir déposé sur chaque ovule une goutte de liquide indifférent. Les ovules peuvent être examinés à l'état frais, soit dans le liquide péritonéal de la Lapine, si l'animal a été sacrifié, ou dans l'humeur aqueuse de l'œil, soit dans du liquide amniotique, du sérum sanguin, du sérum artificiel, ou du liquide de Kronecker.

Quand on n'a pas réussi à trouver les ovules, à l'aide de verres grossissants, soit à la lumière directe, soit à la lumière transmise, on peut passer sur la muqueuse tubaire un petit scalpel qui enlève l'épithélium ; le produit du raclage de la muqueuse est délayé dans un peu de liquide indifférent, et on cherche les ovules à la lumière transmise.

Une autre méthode, employée par Koelliker {Embryologie de Y Homme et des animaux sup., trad. Paris, 1882), consiste à injecter dans l'oviducte, à l'aide d'une petite seringue, de la liqueur de MDller ou de l'acide osmique dilué. Le liquide est reçu dans une série de verres de montre, qui, portés sur le microscope, montrent les œufs avec facilité.

Les quatrième, cinquième et sixième jours après l'accouplement, les ovules de la Lapine sont libres dans les cornes utérines; ils sont bien visibles à l'œil nu, et on les extrait comme de la trompe. A partir du septième jour, les ovules se fixent dans l'utérus, mais ils ne contractent pas encore d'adhérence avec la muqueuse, de sorte qu'on peut les enlever en totalité. A cette époque on distingue, à l'aspect seul de la corne utérine, les endroits où se trouvent les œufs : ceux-ci forment une saillie delà grosseur d'un petit pois. On coupe transversalement la corne utérine en autant de segments qu'il y a de renflements ovulaires, en ayant soin que chacun de ceux-ci soit au milieu de chaque segment. On fixe, au moyen de deux épingles, le segment utérin au fond d'un petit cristallisoir garni d'une couche de cire ou d'une rondelle de liège ; la face mésométriale reposant sur le fond du vase, et le renflement ovulaire étant tourné vers l'obser-

valeur. On remplit alors le vase, soit de sérum, soit de liqueur de MUller, d'une solution d'acide osmique à 1 p. 1000, de liquide de Kleinenberg, d'une solution d'acide nitrique, ou d'une solution saturée d'acétate d'urane. Avec un petit scalpel on pratique à la surface du renflement ovulaire une petite incision longitudinale qui n'intéresse que la tunique musculaire, puis avec deux petites pinces on dilacëre délicatement la muqueuse utérine sous-jacente. On aperçoit alors l'œuf, et, en continuant, on le met facilement en liberté dans le liquide.

Lorsque les œufs sont greffés sur la muqueuse utérine, on ne peut plus les enlever en totalité ; l'embryon se trouvant toujours du côté de la face mésométriale, on ouvre le renflement ovulaire par une incision cruciale et on étend avec des épingles le lambeau de la muqueuse utérine, auquel l'embryon adhère, au fond du vase renfermant le liquide flxateur. En opérant ainsi dans du sérum de Kronecker, à la température du corps, Ed. van Beneden (Archives de Biologie^ t. V, fasc. III, 1885, p. 378) a pu observer la circulation de l'embryon vivant pendant des heures entières; dans ce cas, il faut avoir soin de ne pas trop étendre l'incision cruciale, afln de ne pas intéresser le sinus terminal.

Rëtterer (C R. Soc. de Biologie, 1887, p. 99) recommande, pour les œufs du septième jour, d'ouvrir le segment utérin renfermant l'œuf suivant sa face mésométriale, parce qu'il n'existe pas encore d'adhérence de ce côté. A l'aide d'une pipette, il fait pénétrer du liquide de Kleinenberg entre l'œuf et la face libre de l'utérus et il arrive ainsi à décoller l'œuf qu'il isole sous la forme d'une vésicule close.

557. Lapin, préparation. — La] préparation des ovules et des embryons varie suivant le genre d'observation qu'on se propose de faire. S'agit-il de conserver d'une manière durable des ovules aux différents stades de la fécondation ou de la segmentation. Ed. van Beneden {Archives de Biologie, I, fasc. 1, 1880, p. 149) recommande d'opérer de la manière suivante : l'œuf vivant est porté sur un porte-objet dans une goutte d'acide osmique à 1 p. 100, puis enlevé sur la pointe d'un scalpel et placé dans le liquide de MUller. Après une heure, le liquide est renouvelé et la préparation abandonnée pendant deux ou trois jours dans une chambre humide. On ajoute alors une gouttelette de glycérine très diluée, puis de la glycérine plus pure, enfln l'ovule peut être monté dans la glycérine formique. On peut remplacer le liquide de Millier par le bichromate d'ammoniaque ou

le liquide de Kleinenberg. Si l'on veut obtenir des préparations colorées, après avoir traité Tœuf par Tacide osmique, on le place dans l'alcool au tiers pendant une heure, on le lave avec soin, et on le soumet à Faction du carmin de Beale ou du picro- carmin.

Pour faire apparaître nettement les contours des cellules blastodermiques, on traite l'œuf par le nitrate d'argent. L'œuf vivant est porté directement dans une solution de nitrate d'argent à d/3 p. 100. 11 y séjourne pendant une demi à deux minutes, suivant l'âge de la vésicule. Il est ensuite immergé dans de l'eau pure et exposé à la lumière. L'excès de la solution d'argent qui a pénétré dans l'intérieur de l'œuf ne peut être enlevé par le lavage, aussi les préparations noircissent rapidement et ne peuvent se conserver.

A partir du quatrième jour, la vésicule blastodermique peut être ouverte au moyen d'aiguilles fines; on lave le blastoderme dans l'eau distillée, on le colore par le picro-carminate, le carmin, l'hématoxyline, l'éosine ou des couleurs d'aniline et on monte soit dans la glycérine soit dans le baume. Ed. van Beneden a obtenu aussi de bonnes préparations au moyen de chlorure d'or*

Pour les taches embryonnaires et les embryons plus avancés, KoELUKER recommande l'emploi de Tacide osmique. Il plonge Tœuf .dans une solution à S p. 1000, jusqu'à ce qu'il ait pris une teinte légèrement foncée, ce qui exige environ une heure, puis il le met dans l'alcool faible, et douze heures après dans l'alcool à 33^ Cartier. Si l'œuf adhère à la muqueuse utérine, il laisse le fragment de muqueuse qui porte l'embryon, étendu, au moyen d'épingles, dans une solution d'acide osmique à 1 p. 1000 pendant quatre à six heures. On peut alors enlever facilement la vésicule blastodermique, et on l'immerge encore pendant quelques heures dans une solution d'acide osmique à 8 p. 1000, avant de la mettre dans l'alcool.

Lorsqu'on veut pratiquer des coupes du blastoderme ou de jeunes embryons, il faut fixer avec soin les objets, puis les durcir. Kûelliker donne la préférence à l'acide osmique. Ed. van Beneden traite les œufs par une solution d'acide chromique à 1 p. 400 pendant vingtquatre heures. Ils sont ensuite lavés avec soin et placés dans l'alcool faible, puis dans l'alcool de plus en plus fort et enfin dans l'alcool absolu. L'avantage de l'acide chromique est de durcir la vésicule en maintenant une adhésion parfaite des cellules ectodermiques contre la zone pellucide. Le même auteur recommande aussi le liquide de Kleinenberg comme agent fixateur. Nous avons souvent employé ce liquide pour préparer des taches embryonnaires et des embryons de différents âges et nous avons toujours obtenu de très bonnes prépa-

rations. Le liquide de Flemming, préparé suivant la formule de Fol, nous a aussi bien réussi ; il en est de même du mélange diacide osmique et d*alcooI préconisé par Rânvier et Yignal. Gomme réactif colorant, nous employons le carmin borate ou Thémalun ; si Tembryon est un peu volumineux, le carmin aluné acide permet seul d'obtenir une bonne coloration en masse.

Gomme mflsse à inclusion nous emplpyons la paraffine pure de Merck. Les coupes sont faites en série à Taide du microtome à bascule, à une épaisseur de 1/100 à 1/200 de millimètre et montées dans le baume de Canada.

A consulter aussi Piersol {ZeiL f. wiss. ZooL^ XLVIl, 2, 1888, p. 185); Weyssb {Proc. Amer. Acad. Arts and Sc.j 1884, p. 28o, (vésicule blastodermique de Stis scrofa).

oiseaux

558. Poule, récolte des œufs. — L'œuf de la plupart des Oiseaux commence à se segmenter dans Toviducte; pour étudier les premières phasesdu développement, il faudra donc prendre Tœuf dans les voies génitales de la femelle : le grand développement du vitellus permet de manipuler facilement les œufs. Après la ponte, les œufs sont mis en incubation, soit sous la femelle, soit, ce qui est plus commode, dans un appareil spécial à température constante (couveuse, étuve d'Arsonval, etc.). La température doit être maintenue dans le voisinage de 38"^ G. Si Ton veut conduire le développement assez loin, il faut avoir soin de laisser refroidir chaque jour les œufs pendant quelques instants, de maintenir une certaine humidité dans la couveuse, et de les retourner.

559. Examen superficiel. — Pour étudier Tœuf à Tétat frais, on le place au sortir de la couveuse dans une cuvette assez grande pour qu'il puisse être recouvert de liquide. On verse dans le vase une solution contenant 0,75 p. 100 de chlorure de sodium, chauffée à 38<>. Puis on brise d'un coup sec la coquille à la grosse extrémité, et on agrandit l'ouverture vers la partie supérieure de l'œuf, à l'aide d'une pince ou de ciseaux. L'aire embryonnaire étant mise à découvert, on peut observer à la loupe l'embryon qui continue à vivre assez longtemps dans le liquide indifférent. Si l'on veut examiner l'embryon vivant par transparence, après avoir enlevé une partie de l'albumine, on sort l'œuf du liquide, et on applique à la surface du vitellus un anneau de papier gommé entourant l'aire embryonnaire ; au bout de quelques

minutes, lorsque le papier adhère à la membrane vitelline, on incise circulairement le blastoderme en dehoi*s de Tanneau de papier. On enlève alors cet anneau, après avoir plongé de nouveau Tœuf dans îe liquide indifférent; le blastoderme se détache en même temps que la membrane vitelline et l'anneau de papier, et il peut ainsi être placé dans un verre de montre ou sur une lame de verre et être porté sur le microscope (Duval).

560. Observation sur le vivant (Gerlacu, Nature, 1886, p. 497 ; Joum, Roy, Mie, Soe,, 1886, p. 359). — Enlever avec des ciseaux la coquille du petit bout de Tœuf ; sortir avec une pipette un peu d*albumine ; le blastoderme vient alors se présenter au-dessous de Touverture qu'on a pratiquée, et Ton remet Talbumine. Puis on enduit de gomme arabique les bords de la fenêtre, et sur la gomme on construit un petit mur circulaire avec de la ouate ; sur la ouate on pose un petit verre de montre qu'on y colle avec de la gomme. Lorsque la gomme est assez sèche, on achève de coller le verre de montre par le collodion et le vernis à l'ambre, puis on remet l'œuf dans la position normale dans Tincubateur. Par ce moyen on peut suivre, à travers la fenêtre, le développement de l'embryon jusqu'au cinquième jour, l'œuf étant remis pour chaque observation dans la position verticale.

On trouvera des développements de cette méthode, avec figures d'appareils spéciaux, dans A^iat, Anz,, li, 1887, p. 583-609; voir aussi ZeiL f, wiss. Mik., IV, 3, 1887, p. 3691

561. Fixation et durcissement des œufs d'Oiseaux. — Pendant les premières vingt-quatre heures de l'incubation, il est très difficile de séparer le blastoderme du vitellus ; celui-ci doit être durci en entier, au moins superficiellement.

Pour les œufs d'Oiseaux dont le développement est plus avancé, lorsque l'embryon est déjà apparent, on peut facilement séparer le blastoderme du vitellus, ce qui facilite singulièrement les manipulations. L'œuf ayant été ouvert dans une solution de sel marin, on soulève l'œuf, de manière que le blastoderme fasse saillie hors de l'eau; à l'aide d'une pipette ou d'un tube de verre, on fait tomber à la surface du blastoderme une petite quantité de liquide fixateur (acide osmique à 1 p. 100, mélange d'acide osmique et d'alcool, sérum iodé, liquide de Kleinenberg, acide nitrique à 10 p. 100, etc.). En maintenant le doigt à l'extrémité supérieure du tube ou de la pipette, tandis que l'extrémité inférieure demeure en contact avec le liquide qui recouvre le blastoderme, il reste ainsi au-dessus de l'aire embryon-

naire une quantité suffisante de liquide fixateur qu'on renouvelle au fur et à mesure qu'elle s'écoule, en débouchant de temps en temps l'extrémité supérieure du tube ou de la pipette. Au bout de quelques minutes, lorsqu'on juge la fixation suffisante (lorsque l'aire em* bryonnaire commence à noircir sous l'influence de l'acide osmique, par exemple), on immerge l'œuf dans la solution salée, et à l'aide de petits ciseaux, on pratique une incision circulaire autour de l'aire embryonnaire.

Avec un peu de précaution, on fait alors flotter le blastoderme excisé et on le conduit dans un verre de montre, en ayant soin de le maintenir aussi bien étalé que possible. On peut ainsi le sortir du vase qui contenait l'œuf, et le transporter, soit sous le microscope, pour l'examiner directement, soit dans le réactif durcissant. Au préa» lable, on- enlève, à l'aide de pinces et de quelques secousses dans le liquide, le lambeau de membrane vitelline qui recouvre le blastoderme.

Pour prévenir le recoquillement des bords du blastoderme pendant le durcissement Romiti recommande de placer celui-ci sur la face convexe d'un verre de montre {DolL Soc. Cuit. Se. Med. Siena, III, 1885; Journ. Roy. Mie. Soc., VI, 1886, p. 870).

La fixation par Tacide nitrique à 10 p. 100 présente l'avantage de faciliter beaucoup la séparation du blastoderme. On laisse agir l'acide pendant dix minutes, et l'on porte dans de la solution d'alun à 2 p. 100(HoFMANN, Zeil. f. wiss. Mik., X, 4, 1893, p. 483).

Pour le durcissement, Foster et Balfour [Éléments dC embryologie) recommandent le liquide de Kleinenbcrg pendant cinq heures, puis l'alcool. On peut employer aussi l'acide chromique, une solution à 1/1000 pendant vingt-quatre heures, puis une solution plus forte à 3/1000 pendant encore vingt-quatre heures ; l'embryon est mis ensuite dans l'alcool à 70*», pendant un jour, dans l'alcool à 90** pendant deux jours, et enfin dans Talcoôl absolu. Si la préparation n'est pas absolument débarrassée d'acide chromique, il faut avoir soin de changer l'alcool jusqu'à ce que l'acide ait complètement disparu.

Foster et Balfour ont employé aussi une solution d'acide osmique à 0,5 p. 100, dans laquelle on laisse l'embryon pendant deux heures et demie, à l'obscurité et dans un vase fermé. On met ensuite la préparation dans l'alcool absolu, en prenant soin d'enlever complètement l'acide par plusieurs lavages à l'alcool.

Nous préférons l'emploi simultané de l'acide osmique et de l'alcool, d'après la méthode de Ranvier et Vignal (n*> 39), ou du liquide

ANAT. UICROSC. 22

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de Flemming, avec durcissement dans des alcools de plus en plus forts.

La coloration et Tinclusion des embryons d'Oiseaux ne présentent rien de spécial.

502. Méthode de Mathias Duval [Ann. des Se. nat. ZooL, 1883). — Dans les premiers stades du développement de l'œuf d'Oiseau, avanl l'apparition de la ligne primitive, il est difOcile d'orienter la cicalricule durcie, afin de pratiquer des coupes suivant une direction déterminée. M. Duval, se basant sur ce fait que dans l'œuf incubé Fembryon est presque toujours cour.hé sur le jaune, de telle sorte que Le gros bout de l'œuf est à sa gauche et le petit bout à sa droite, oriente le blastoderme de la manière suivante. Avec une petite bande de papier, large de 5 millimètres et longue de 50 millimètres, on fait une sorte de cuvette triangulaire sans fond. Celle-ci est appliquée à la surface du jaune, autour de la cicatricule, de façon que sa base réponde à la future région antérieure, et son sommet à la future région postérieure de l'embryon. C'est-à-dire que si le gros bout de rœuf est à la gauche de l'observateur , le triangle en papier aura son sommet dirigé vers l'observateur.

Avec une pipette on remplit la cuvette en papier d'une solution d'acide osmique à 1 p. 300 ; au bout de quelques minutes, quand le fond de la cuvette commence à noircir, on dépose l'œuf dans une solution faible d'acide chromique : l'albumine est enlevée, et la pièce est mise dans une solution propre d'acide chromique, où elle durcit en quelques jours. Il reste sur la sphère vitelline une surface triangulaire noire, comprenant la cicatricule et indiquant de quel côté se trouve la partie antérieure ; on détache avec un scalpel et de fins ciseaux cette portion triangulaire, dont on achève le durcissement par l'acide chromique et l'alcool.

Duval conseille aussi d'activer le durcissement en plaçant l'œuf, apris l'action de l'acide osmique, dans une solution chromique qu'on porte à l'ébullition au bain-marie : après refroidissement, on enlève la région du triangle noir, qui est ensuite durcie plus complètement par l'acide chromique et l'alcool.

La pièce durcie est montée dans le coUodion ; on pratique le collodionnage des surfaces de section, et les coupes sont colorées par une solution de picrocarmin étendue d'une forte proportion de glycérine,

A consulter, la critique et modification de cette méthode par Kionka {i4/iii(. Hefte, X, p. 391 ; Zeit. f. wiss. MiL, XI, 2, 1894, p. 250 (coloration

Googh

par le carmin boracîque, en ajoutant à Talcool acidulé de lavage quelques gouttes de solution aqueuse d'orange G, qui colore le vitellus en jaune).

563. Préparation de l'embryon tout entier. — Lorsque Tembryon a été fixé par Tacide picrique, Tacide osmique ou le sérum iodé, puis durci par l'alcool, on peut, jusque vers la cinquantième heure environ, en faire des préparations permanentes en surface. L'embryon est coloré par Tune des méthodes indiquées ci-dessus, puis monté dans la glycérine ou dans le baume, après déshydratation. A partir du troisième jour, l'embryon est trop volumineux pour pouvoir être commodément préparé ainsi en totalité.

Cependant, avec beaucoup de patience, on y arrive, même après deux semaines d'incubation, en enlevant soigneusement la coquille morceau par -morceau, tout en laissant les membranes entières, voyez IIiROTA, Journ, Roy. Mie. Soc.^ 1898, p. 118.