OBTENTION DE LA PRÉPARATION

Véhicules. — Avant toutes choses, établissons que l’objet n’est que très rarement observé à sec, c’est-à-dire simplement déposé sur une lame et abrité ou non par un cower (os), et que, tout au contraire, il est le plus souvent placé dans une goutte de liquide bien transparent, sans action sur lui, que l’on nomme véhicule. Parmi les véhicules les plus employés, certains (eau, glycérine additionnée d’un tiers d’eau) conservent toujours leur consistance liquide, d’autres (résines, gélatine) passent, peu après l’usage, à l’état solide et emprisonnent l’objet.

L’eau et la glycérine peuvent devenir nuisibles en certains cas; il faudra s’adresser alors à des liquides spéciaux (iodosérum, etc.) ne s’appliquant qu’à des cas restreints que nous signalerons en temps et lieu.

Les véhicules solidifiables sont : 1° le baume ou térébenthine du Canada qu’il faut souvent ramollir par une douce chaleur avant d’y plonger la préparation; 2® la solution chloroformique de résine dammar^', 3“ les bons vernis incolores cl l’alcool du commerce (vernis à étiquettes, par

d. Ces véhicules, fort épais, sont conservés dans des flacons ad hoc, à large ouverture, clos à l’émeri par un couvercle. On les manipule au moyen de petites baguettes de verre conformées en cure-oreilles.

TECHNIQUE GÉNÉRALE

exemple^) L Ces véhicules, ayant tous pour base une résine, exigent que la préparation soit bien sècbe ou complètement privée d’eau par Talcool, ce qui n’est pas toujours possible. On leur substituera alors la gélatine glycérinée que l’on obtient en faisant gonfler, puis dissoudre, dans 3 parties d’eau distillée une partie de grénétine bien blanche, et ajoutant au mélange chaud 4 parties de glycérine. Cette préparation est amenée au moment du besoin à consistance convenable parla chaleur du bain-marie.

Certains laissent les véhicules résineux se solidifier seuls et lentement, d’autres hâtent la prise en chauffant la préparation : les essences ou le dissolvant sont chassés, la résine se solidifie par le refroidissement. On obtient ainsi les préparations à sec, appellation impropre. Beaucoup de Diatomées sont montées de cette façon.

Des préparations. — Décrivons maintenant les dilférents modes opératoires nécessités par les états fort divers dans lesquels se présentent les corps à observer.

1" Si la substance est en suspension dans un liquide et s’ g trouve en quantité considérable (hématies dans le sang), il suffira de puiser avec une pipette une gouttelette du liquide, de la déposer sur la lame et de fy étendre soit avec l’aiguille, soit par de petits mouvements saccadés imprimés au porte-objet. Le liquide sert ici de véhicule.

2'" La substance étant encore en suspension dans un liquide ne s'y rencontre quen quantité minime. — Le liquide est versé dans un verre conique et abandonné au repos pendant plusieurs heures. La matière se rassemble à la surface ou au fond du vase selon sa densité ; elle est recueillie par décantation avec un peu du liquide ambiant. On est ramené ainsi au cas précédent (analyse des sédiments urinaires).

3^ Le corps est pulvérulent. On n’en prend qu’une quantité fort minime en roulant dans sa masse une aiguille droite très légèrement humectée. En agitant ensuite celle-ci dans la goutte de véhicule déposée sur la lame elle lui abandonne la poudre dont les éléments peu serrés laissent facilement passer la lumière et analyser leurs contours (analyse des fécules).

4“ Le corps est filamenteux. — S’il n’est pas contractile et doit être étudié selon la longueur, il sera tout simplement déposé dans le véhicule et redressé, s’il en est besoin, au moyen des aiguilles. S’il est contractile, il sera porté sur une lame bien sèche et y sera fixé par une de ses extrémités au moyen d’une goutte de cire ou de paraffine, on l’étendra, puis on fixera la seconde extrémité comme la première. On versera seulement alors le véhicule.

i. Je fais depuis longtemps usage du vernis à étiquettes et je m’en trouve fort bien. Sa fluidité le rend plus commode que les autres liquides.

THATTÉ PRATTOrr. DP MIGRüGHAPHTK

Si l’on désire des coupes, on réunira plusieurs filaments en les disposant parallèlement, afin que le rasoir les rencontre tous dans la même position, puis on les encastrera. Les filaments contractiles ne seront encastrés qu’après avoir été tendus comme il a été dit un peu plus haut. Le collodion convient bien à ce cas.

5'’ Le corps est membraneux. — On peut l’étudier de plusieurs façons.

a. On le laisse entier. S’il est rigide (épiderme des végétaux), il suffit de l’immerger dans le véhicule en tenant compte, si les deux faces sont dissemblables, du côté que l’on tourne vers l’objectif. S’il est mou et s’est plissé, il sera étendu dans le véhicule, au moyen des aiguilles, avant d’être recouvert par la lamelle. S’il est contractile, on le portera sur une lame sèche et on fixera d’abord une de ses extrémités par la pression du doigt maintenue assez longtemps pour amener l’adhérence ; on étendra la membrane et l’on fixera comme précédemment le côté opposé. Le véhicule ne sera déposé qu’après cette manipulation.

b. On l'étudie en coupe. Si la membrane présente une résistance suffisante, elle sera encastrée dans une pince de moelle de sureau. Si elle est molle et qu’elle ne puisse supporter l’encollage, on la fixera au sortir de l’alcool sur une feuille de papier à filtre qui lui donnera la résistance suffisante pour être introduite dans la pince de sureau. Le durcissement par l’alcool suffit généralement pour les membranes végétales.

c. On peut avoir recours à la dilacération lorsqu’on veut tout simplement étudier les éléments séparés. Une petite portion de l’objet, qui a été préalablement traitée, s’il y a lieu, par les isolants, est portée sur la lame dans une goutte de véhicule, et, tandis qu’elle est maintenue dans le liquide par la main gauche armée d’une aiguille, la droite portant une seconde aiguille lui fait subir une suite de tractions dans le sens de la moindre résistance, tractions qui finissent par la diviser en ses élémenls. On enlève, avant de recouvrir de la lamelle, les portions qui ont résisté.

corps est massif . — Il est alors rarement assez transparent pour être déposé directement dans le véhicule; il faut, en effet, dans la plupart des cas qui semblaient propices au premier abord, avoir recours aux matières éclaircissantes dont nous allons bientôt parler. Il faut employer presque toujours avec les corps massifs la dilacération ou le rasoir avec lequel on les réduit en tranches minces appelées coupes.

La dilacération se fera sur une petite quantité de matière et sur le porteobjet comme nous l’avons dit précédemment.

Coupes. — Si la matière n’est ni trop volumineuse ni troj) résistante, elle pourra être débitée immédiatement et sans intermédiaire. Dans les autres cas on lui fera d’abord prendre la consistance voulue, puis, s’il le faut, elle sera encastrée. A mon avis on devrait toujours encastrer la substance, car

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la maiioro adjiivanle facilite singulièrement l’action du rasoir en empêchant l’objet de fuir sous la pression de la lame ; en tous cas, l’objet non encastré doit être appuyé sur un corps un peu résistant : du sureau préférablement à du liège. Si l’objet présente une large surface, il faudra absolument employer un microtome (voy. pag. 32).

Il est indispensable de bien orienter la pièce alin d’éviter les coupes obliques qui, en ne laissant voir ni la projection transversale, ni la projection longitudinale des éléments, ne peuvent donner que des idées fausses. Il faut débiter la matière en tranches minces, d'épaisseur égale, présentant des faces rigoureusement parallèles. Pour arriver à ce résultat, on fera d’abord tomber avec le rasoir toute la partie supérieure de la pièce afin de l’égaliser; les coupes seront obtenues ensuite, quelle que soit la largeur de la subslance, par un seul coup du tranchant que l’on fera courir obliquement du manche au sommet par un mouvement qui rappelle le coup d’archet. Le déplacement du rasoir sera rapide sans être précipité, continu, ferme sans aucune hésitation, car rinstrument laisse, sous forme de crête ou de sillon, l’empreinte de chaque nouvelle morsure. La surface libre sera égalisée de nouveau après chaque coupe défectueuse.

Lorsqu’on ne fait point usage du microtome, il est bon de placer la matière dans l’angle formé par la phalangette de l’index gauche légèrement inclinée sur la phalangine et de l’y maintenir avec le pouce de telle façon que sa face supérieure neproémine que légèrement au-dessus du doigt indicateur. Le rasoir en action glissera sur la saillie que forme la dernière articulation de l’index ; il y trouvera un guide et un appui.

On fait sans désemparer une douzaine de coupes que l’on précipite, aussitôt faites, dans un petit cristallisoir contenant assez d’eau ou d’alcool pour qu’elles puissent flotter librement; les éléments comprimés par le rasoir retrouvent dans le liquide leur forme primitive; les coupes ebiffonnées s’y étalent. On compare les préparations et l’on fait choix des plus convenables. Les coupes les plus minces ne sont pas toujours les meilleures : ainsi les tissus mous des végétaux charnus ne peuvent être bien étudiés que sur des coupes relativement épaisses.

La coupe ne sera transportée sur la lame qu’après que celle-ci aura reçu le véhicule, sans quoi il y a danger d’emprisonner au-dessous d’elle de flair, ce qui a, nous le verrons, le plus grand inconvénient. Pour la même raison, le cower, pour être appliqué sur la préparation, sera, dans tous les cas, tenu obliquement de façon à ce qu’une de ses arêtes plonge d’abord dans le véhicule; on lui imprimera ensuite un mouvement de volet sur cette arête afin que ses différents points puissent en se mouillant successivement, chasser l’air devant eux.

TRAITÉ PRATIOUE DE MICROGRAPHIE

Malgré tout le soin que l’on ait apporté à effectuer les opérations précédentes, la préparation laisse encore parfois à désirer, soit qu’elle renferme de l’air ou que les tissus ne laissent pas passer la lumière ou que, trop transparents au contraire, ils ne laissent pas saisir les lignes de démarcation. Il faudra chasser cet air, éclaircir les tissus opaques, teinter les tissus trop diaphanes.

Bulles d'air. — L’air se rencontre presque inévitahlement lorsque le tissu est spongieux ou que la préparation n’a pas été montée avec tout le soin nécessaire ; il se présente soit en nappes, soit en bulles. En nappes, il obscurcit la surface qu’il baigne, lui fait perdre toute netteté, mais cependant la laisse encore deviner; son contour est marqué par un fin liséré noir qu’il faut apprendre à connaître. Il est bien plus désagréable encore lorsqu’il se présente en bulles (/^fig. 2, 3, pl. Il), car non seulement il voile alors complètement le point qu’il recouvre, mais il donne lieu à des jeux de lumière qui se traduisent le plus souvent par un point fortement éclairé entouré d’une ligne plus ou moins épaisse entièrement obscure ou irisée. Pour s’en débarrasser, on immergera la coupe pendant quelques minutes dans l’alcool avant de la porter dans le véhicule, ou, si cette opération est impossible, on la montera sur le porte-objet dans un véhicule peu volatil que l’on chauffera avec précaution, sous la lamelle, jusqu\à l’ébullition. On cessera Faction de la chaleur aussitôt après le départ des trois ou quatre premières bulles, qui auront presque certainement entraîné la totalité de l’air, afin d’éviter le choc répété de la lamelle retombant sur la coupe après avoir été soulevée par les bulles gazeuses.

Des éclaircissants. — Après la glycérine dont l’action est lente, mais de plus en plus accentuée, l’éclaircissant le plus employé est la potasse en solution aqueuse ou alcoolique au dixième. Ce corps agit surtout sur le protoplasma, sur les parois cellulosiques, sur les tissus épithéliaux animaux et leurs dérivés (ongles, cheveux, etc.); mais son action énergique doit être suivie de près : ainsi les coupes végétales suffisamment éclaircies seront lavées à grande eau avant d’être montées pour être complètement privées du réactif. On peut substituer à la potasse la lessive des savonniers étendue de 2 volumes d’eau. Lorsque la substance ne résiste pas à ces deux alcalis, on les remplace par l’ammoniaque. On opérera à froid ou à chaud, selon les cas. L’acide acétique rend le protaplasma soluble dans l’eau et met les noyaux en évidence. J’emploie journellement la solution suivante : Acide acétique 1, glycérine 4, eau distillée I ; elle agit non seulement sur le protoplasma, mais aussi sur la chlorophylle à laquelle elle fait perdre la coloration verte, mettant la xantbophylle en évidence, surtout si l’on s’aide du concours de la chaleur.

Les coupes épaisses des tissus végétaux jeunes, riches en protoplasma

ti^:gi[nioue générale

(points végétatifs), seront traitées'^'soit par le chlorure de calcium, soit par l’alcool et d’acide azotique, en employant les tours de main suivants :

Chlorure de calcium. — On place la coupe dans un verre de montre avec deux gouttes d’eaii, puis on la saupoudre de chlorure de calcium sec en poudre. On amène presque à siccité par une douce chaleur, on lave à grande eau. On monte dans la glycérine. Le contenu est assombri, mais les parois deviennent claires et brillantes.

Alcool et acide azotique. — On plonge la préparation dans l’alcool à 90“ et on ajoute de l’acide azotique goutte à goutte jusqu’à dégagement de vapeurs rutilantes. Si la température est froide, on chauffe le tube dans lequel on opère pour faciliter l’action. En quelques minutes ou quelques secondes, selon l’épaisseur du tissu, le contenu des cellules est détruit. On lave à grande eau et on porte dans la glycérine. Si le trailement avait rendu le tissu trop fragile, on décanterait l’eau de lavage etonla remplacerait par quelques gouttes d’alcool qui procureraient la résistance convenable.

On a plus souvent recours en histologie animale à l’essence de girofle ou à la créosote: la coupe dégommée, puis colorée s’il y a lieu, est privée d’eau par un bain dans l’alcool à 90“ ; elle est ensuite plongée, après avoir été essuyée sur du papier à filtre, dans quelques gouttes du liquide éclaircissant placées dans un verre de montre; elle y est abandonnée quelques minutes, puis elle est montée, ayant été de nouveau essorée, dans un véhicule résineux qui agit aussi comme éclaircissant.

Des colorants. — Je me bornerai ici à énumérer les principaux colorants et à donner le moyen de les préparer, renvoyant à la technique spéciale pour les colorants spéciaux et leur mode d’emploi.

Iode. — On a depuis longtemps préconisé l’eau iodée et la teinture d’iode ; à ces deux préparations trop peu ou trop chargées je préfère la solution au centième d’iodure de potassium saturée d’iode. Le liquide, très altérable en raison de la grande volatilité de l’iode, sera maintenu en bon état par Éaddition de quelques cristaux du métalloïde. Il colore en brun les substances albuminoïdes, en bleu l’amidon. C’est le réactif par excellence des substances protéiques.

Solution de carmin. — Triturez pendant quelques minutes dans un mortier 0 gr. 50 de carmin fin, n° 40, avec une dizaine de gouttes d’ammoniaque. Ajoutez 100 grammes d’eau distillée. Conservez plusieurs jours dans un flaçon fermé tout simplement par un cornet de papier afin de permellre l’évaporation de l’ammoniaque non combinée. Filtrez ensuite. On peut remplacer une partie de l’eau par de la glycérine. Cette solution colore le protoplasma en rose, les noyaux en rouge. Les acides en précipitent le carmin ; on utilise cette propriété pour fixer ce corps dans ses lieux d’élection : la coloration est faite sur la lame dans le carminate d’ammoniaque

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servaiil de véhicule, on déplace ensuite celui-ci par une goutte de glycérine additionnée d’acide acétique ou formique à 10/0 déposée le long d’un des côtés de la lamelle; la solution de carmin est aspirée en même temps par un petit morceau de papier à filtre appliqué contre l’arête de la lamelle diamétralement opposée à la précédente. Il y a substitution d’un liquide à l’autre sans aucun mélange; si les choses se passaient autrement, il y aurait formation d’un fin précipité de carmin qui souillerait la préparation.

On a proposé pour des cas spéciaux des solutions boratées et alunées de carmin.

Picrocarminate d ammoniaque . — Si dans la préparation précédente on remplace l’eau distillée par quantité suffisante d’une solution aqueuse saturée d’acide picrique pour obtenir une liqueur rouge-sang, on aura le picro-carminate d’ammoniaque, le colorant habituel des tissus animaux. Cette solution doit être aussi peu ammoniacale que possible. Elle dépose avec le temps; de plus, elle est facilement envahie par des végétations, faits qui nécessitent des filtrations répétées. Elle colore les tissus en rose ou en jaune selon leurs qualités électives et permet ainsi la distinction d’éléments différents mélangés.

Uacide osmiqne en solution aqueuse à 1 0/0 colore les graisses et la myéline en noir.

Le nitrate d argent en solution aqueuse à 1 0/0 est employé dans les imprégnations pour montrer les limites des cellules endothéliales qu’il colore en noir.

La teinture alcoolique d’orcanette (1/5) colore en rouge les corps gras et les résines.

Le chloro-iodure de zinc est le réactif par excellence de la cellulose pure qu’il colore en bleu-violet.

ïîématoxyline. — Cette liqueur violette qui abandonne facilement sa matière colorante aux noyaux s’obtient par le mélange des deux solutions suivantes : 1° bématoxyline, 0 gr. 35; alcool à 95°, 10 grammes; 2° alun (alcalin)^ 0 gr. 10; eau distillée: 30 grammes. Elle s’altère rapidement; il est prudent de n’en préparer que peu à la fois.

Purpurine. — Dans une solution bouillante d’alun à 0,5 0/0 jetez une petite quantité de purpurine broyée dans l’eau distillée ; la solution se fait rapidement. Filtrez le liquide chaud dans un flacon contenant un volume d’alcool à 90° égal au tiers de la solution aqueuse.

Bleu de Prusse. — Prenez bleu de Prusse soluble 1 gramme, acide oxalique 0 gr. 25. Broyez avec une petite quantité d’eau. Laissez en contact quelques minutes, puis ajoutez quantité suffisante d’eau distillée pour obtenir 100 grammes de liqueur.

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Salraninc. — Mélangez les deux solutions suivantes : r alun (),o0, eau 10; 2'’ safranine 0,50, alcool 10 grammes. Colore les noyaux.

Fiicfmne. — Sa solution alcoolique est quelquefois employée par les zoologistes. Les botanistes font grand cas de sa solution ammoniacale^ pour la coloration des parois lignifiées ou subéreuses. Pour Tobtenir, triturez dans un mortier une petite quantité de fuchsine avec quel(|ues grammes d’alcool à 90” de façon à obtenir une solution fortement colorée. Versez-la dans un flacon et ajoutez-y de l’ammoniaque en agitant constamment jusqu’à ce que la masse prenne la teinte paille. Laissez reposer plusieurs jours, filtrez et conservez en vases clos. On peut employer cette liqueur pure et mieux étendue de plusieurs volumes d’eau distillée. Les préparations y resteront immergées pendant plusieurs minutes, puis seront lavées à beau distillée, portées ensuite dans un bain d’eau distillée additionnée de quel- (jues gouttes d’acide acétique (|ui amènera la fixation et l’apparition de la teinte rouge ; la préparation lavée de nouveau à beau distillée sera montée dans la glycérine neutre.

On prépare des solutions alcooli(|iies à 1 0/ü (ïéosine, de violet de Paris (violet de métliyl-aniline, Nr BBBBB), de brun d'amline (brun de Bismarck) qui serviront à obtenir, au moment du besoin, les solutions aqueuses étendues (au millième environ) dont on fait seulement usage. Les préparations colorées avec l’éosine seront montées dans la glycérine salée à 2 0/0 , celles qui auront été teintes par le violet de Paris seront conservées dans une solution aqueuse saturée d’acétate de potasse ou dans de la glycérine fortement chargée de sel (5 0/0).

La cijanine ou bleu de quinoléine sera dissoute dans cinquante fois son poids d’alcool à 90” et le liquid(î sera étendu de moitié de son poids d’eau. La solution aqueuse de ce corps colore le protoplasma sans le tuer.

YiQbleu d'aniline est employé en solutions aqueuses très étendues (1 0/0).

Le vert de méthyle est actuellement le réactif par excellence des noyaux, il est surtout précieux dans l’étude de la division de cet organisme dont il ne colore que le filament de chromatine. On doit faire usage uniquement du vert-lumière et rejeter le vert-lumière à l’iode. On peut l’employer en solution aqueuse très- étendue, mais, cette préparation étant peu stable, il est préférable d’additionner la solution de 1 0/0 d’acide acétique Non seulement la conservation est ainsi assurée, mais la fixation est plus accentuée; celle-ci réussit rapidement avec les tissus durcis dans l’alcool. On conservera les préparations dans delà glycérine légèrement teintée par addition de quelques gouttes de la solution acétique. Les préparations montées au baume de Canada sont inaltérables ; lorsqu'on désire employer ce mode de conservation, bon doit colorer fortement la coupe, puis enlever