MÉTHODES DE DISSOCIATION ET DE DISSECTION

Pour étudier les éléments de certains tissus, il est nécessaire de les écarter et de les isoler les uns des autres, soit par des moyens mécaniques, soit par des moyens chimiques, soit par la combinaison de ces deux espèces de moyens.

Moyens mécaniques. — Dissociation avcc les aiguilles. — Lorsr qu'il s'agit de séparer à l'aide des aiguilles les parties élémentaires d'un tissu, il se présente à l'histologiste des difficultés de divers ordres. 11 est nécessaire, en premier lieu, de voir trèsnettement l'objet, ce qui n'est pas toujours facile; en second lieu, il faut posséder sur la structure du tissu que l'on veut dissocier quelques notions élémentaires préalables, afin de ne pas appliquer les aiguilles au hasard, ce qui pourrait, ou bien empêcher de séparer les éléments, ou bien ahérer précisément les parties que l'on veut examiner.

Si la dissociation se fait à Tœil nu, avec une simple loupe ou avec la loupe de Brûcke, il faut avoir soin de se placer dans le meilleur jour; mais cette précaution ne suffit pas. Si la lame de verre sur laquelle est placé le fragment de tissu repose directement sur la tiible de travail, il peut se faire qu'on ne le distingue pas nettement ; aussi faut-il choisir un fond approprié : noir si les tissus sont blancs, blanc si les tissus sont colorés; de cette manière on voit beaucoup mieux l'objet. Mais, lorsqu'il est sur

Tond blanc, on ne le distingue pas encore nettement, parce que les ombres projetées parles diflerentes parties du tissu sur le fond que Ton a mis au-dessous de la lame de verre viennent se mêler avec l'image de l'objet et en altèrent la netteté. Pour éviter cette diflieulté, les histologistes, au lieu de poser directement la lame de verre sur laquelle ils dissocient sur la table ou sur une feuille de papier, peuvent la faire reposer sur les bords d'un petit baquet de porcelaine, de manière à se procurer un fond distant de Tobjet, et où l'ombre projetée obliquement ne se confond plus du tout avec l'image de cet objet.

Nous nous servons dans notre laboratoire d'un ^o^ûi photophore^ Phoiophow. qui réunit les différentes conditions nécessaires pour dissocier avec avantage à l'œil nu ou avec la loupe de Urùcke. Il se compose d'une petite caisse de bois d'environ 5 centimètres de haut, sur 10 à 42 centimètres de long et de large. La paroi antérieure est enlevée, et la paroi supérieure est formée par une lame déglace. Dans cette caisse, on dispose un miroir de glace incliné en bas et en avant et formant avec l'horizon un angle de 25 à 30 degrés, de manière à renvoyer directement de bas en haut les ravons lumineux.

Sur la plaque de verre qui recouvre la caisse, on place la lame où se trouve la préparation, et elle est aussi bien éclairée que possible. Pour voir bien nettement les objets colorés, il suffit déplacer sur le miroir une feuille de papier blanc; les objets se détachent admind)lement sur ce fond, et leur ombre, réfléchie obliquement et en arrière de la préparation, ne vient pas nuire â la netteté de leur image. Quand on a afl'aire à des objets blancs, on remplace l'écran blanc par un écran, noir sur lequel toutes leurs parties se détachent avec netteté. Cet appareil ne doit pas avoir plus de 5 à 6 centimètres de hauteur; autrement il devient incommode, parce que les mains n'ont plus un point d*appui solide sur la table de travail.

Lorsque les éléments qu'il s'agit de séparer et d'isoler sont trop petits pour être visibles à l'œil nu ou à la loupe de Brûcke, il devient nécessaire de se servir du microscope. On peut alors procéder de deux façons. Ou bien placer la préparation sous le microscope, la considérer attentivement avec un faible grossissement, de manière à se rendre bien compte de la façon dont est situé l'objet à isoler : une cellule nerveuse par exemple, par rapport à des parties de tissu assez considénables pour être visibles

DinocUtion

sous le microscope.

à l'œil nu; puis retirer la préparation de la platine, et, en la plaçant sur le photophore, la dissocier avec les aiguilles coirmie nous allons le dire tout à l'heure, en calculant approximativement le point où se trouve la cellule nerveuse. Ce procédé est sujet à bien des chances d'insuccès, et cela se comprend facilement; cependant il donne entre des mains exercées d'assez bons résultats. L'autre procédé est de disséquer et d'isoler les éléments directement sous le microscope. Il y a alors à vaincpî deux difficultés : la première est la dimension (considérable que prend rimaj^e dos aiguilles; la seconde, c'est le renversement de l'image, par suite duquel on croit porter Taiguille à droite quand on la porte à gauche, et réciproquement. Avec un peu d'exercice, cet inconvénient est moindre qu'au premier abord. redîîSw». On a inventé, poui y obviei*, des prismes redresseurs jdacés audessus de l'oculaire.

Avant de quitter ce sujet, nous indiquerons un moyen qui nous a paru avantageux pour terminer l'isolation d'une cellule nerveuse. Il consiste à laisser tombei* sur l'endroit où elle se trouve une petite goutte de liquid<î qu'on y apporte à la pointe de l'aiguille. Le liquide écarte les fibrilles et les petits objets voisins, et souvent par ce piocédé nous avons obtenu, libre et isolée, une cellule nerveuse que nous n'aurions séparée» avec les aiguilles qu'en sacrifiant un ou plusieurs de ses prolongements. Manière En sccoud licu, avous-uous dit, il est indispensîible, avant d'ap-

aiguille», pliquer les aiguilles à un tissu, d'avoir quelques notions élémentaires sur sa structure. On ne dissocie pas en effet tous les tissus de la même façon, et il est urgent de savoir dans quel sens les éléments sont • disposés, s'ils sont parallèles ou entrecroisés, d«^ manière à agir suivant la direction où l'on obtiendra le plus facilement l'isolation.

Ainsi pour les muscles, il est essentiel, avant de procédera leur dissociation, de savoir qu'ils sont composés de fibr(>s parallèles, et de se rendre compte du sens dans lequel elles sont dirigées. Cette structure fibrillaire se voit parfaitement à l'œil nu ; aussi faut-il prendre pour le dissocier un fragment dont la longueur corresponde à la direction des fibres. Cela fait, on applique les aiguilles à Tune des extrémités du fragment de tissu, on les écarte de manière à produire une fente de dissociation que* l'on augmente en écartant de plus en plus les aiguilles jusqu'à diviser l'objet en deux. Puis, sur une des moitiés, on répète l'opération en

MÉTHODKS DE DISSOCIATION. 73

plaçant toujoui-s les aiguilles au même bout du IVagmoiit inus(îulaire, et en les employant pour le séparer en filaments de plus i*n plus fins. Les aig^uilles doivent être appliquées toujours au nu>nie point de la préparation, parce que les fibres nuisculaires qu'il s'agit de dissocier sont si délicatcîs, que tous les points touchés directement par Taiguille sont altérés et ne peuvent plus îjer\'ir à Tobservation. En opéi*ant comme nous venons d'indiquer, on peut arriver à dissocier jusqu'aux faisceaux primitifs sans avoir altéré autre chose qu'un(^ dos extrémités des ftiisceaux.

S'il s'ajçit de dissocier des nerfs, il est nécessaire aussi de savoir qu'ils sont composés de faisceaux et de tubes nerveux parallèles disposés dans le sens de la longueur du nerf; il faut déplus savoir que les faisceaux nerveux sont cntourc's d'unes {^ahic» résistante, et qu'on ne peut séparer les tubes dont ils sont composés qu'après avoir enlevé cette fcaîne. Partant de ces notions, h nerf, convenablement préparé, est dc'bariassé de sa j^aîne, (*t son contenu est dissocié avei- les mêmes précautions que nous venons d'indiquer pour les fibres nmsculaires, caries tulx^s nerveux sont encore plus facilement altérables que ces libn\s.

Ix)rsqu'on a affaire à un tissu dont les éléments sont (înlre- dessicSiïoii. croisés, comme le tissu conjonctif j)ar exemple, il survient une nouvelle difficulté : si hîs aiguilles sont appliquées dans un sens, le tissu se laisse étirer dans cettcî direction; mais lorsqu'on les applique dans une direction perj)endiculaire à la priMuière, il se laisst» étendre dans ce sens, et revient sur lui-même dans l'autre, d(» sorte qu'on ne peut l'étaler convcMiablement. Le m(»illi'ur moyen d'obvier à cette dilliculté, c*est d(^ placer li' tissu sur la lame d(î verre siuis li(|uide et de l'étendre modérément; Il se dessèche peu à peu, et les parties à demi desséchées adhèrent * assez à la lame pour former un point d'appui et résistei* à la traction qu'on exerce à l'autre extrémité. Nous nniendrons, à propos Au tissu conjonctif, sur les détails i)ratiqu(\s de cette méthode; nous ajouterons seulement ici qu'il faut opérei* rapidement avant que la dessiccation soit trop avancée, et <jue ce procédé ne peut être employé pour des objets que la demi-dessiccation pouirait altérer dans leur fonne.

Loi's(pie des fragments de tissu à demi isolés gênent l'observateur, il arrive facilement à les séparcîr en un point quelconque en appliquant fortement à ce point sur la lam(» de verre l'aiguille à dissocier, qui agit comme un sc4dj)el.

Ces exemples suffisent pour montrer les précautions qu'il faut prendre dans la dissociation avec les aiguilles, pour être assuré d'avoir de bons résultats.

Dissociation par a^jilation dans les liquides. — Lorsque les éléments sont retenus faiblement les uns aux autres, comme par (wemple les cellules d'un épithélium, il est facile de les dissocier sans y toucher. L'objet est mis avec un liquide neutre dans un lube que Ton agite; les cellules se détachent les unes des autres, et une goutte du liquide prise au fond du tube en contient suffisamment pour les examiner.

Tne méthode analogue consiste à placer un petit fragment de l'objet sur une lame de verre avec une goutte du liquide additionnel. On incline la lame d'environ 20 degrés, de manière que la goutte se rassemble un peu au-dessous de l'objet, mais pas assez pour qu'elle s'écoule, et, avec une aiguille, on agite l'objet dans le liquide de manière à en détacher quelques cellules. Ces cellules ont gagné, à mesure, la partie inférieure de la goutte d'eau, ainsi qu'on peut s'en assurer par l'examen microscopique.

Méthode des injections interstitielles^ ou œdèmes artificiels. — Lorsque des tissus sont constitués [)ar des réseaux de filamenti^ intriqués dans tous les sens, on réussit très-bien à les séparer de manière à les voir nettement à l'aide des injections interstitielles, qui rentrent ainsi dans cette méthode générale de dissociation. On se .^ei1 pour cela d'une seringue hypodermique montée soit en argent, soit en caoutchouc durci, et munie d'une canule d'or. On peut injecter de l'eau, du sérum, des matières colorantes, du nitrate d'argent, ou aussi des substances solidifiantes comme de la gélatine.

Si l'on injecte de l'eau ou un liquide analogue, il faut pousser rinjection rapidement, par exemple dans le tissu cellulaire souscutané ; les fibres sont refoulées les unes contre les autres, et il se fait une boule de liquide entourée par ces libres qui forment autour d'elle comme une membrane d'enveloppe. On coupe alors an fragment du tissu, on l'étalé sur la lame et l'on recouvre. Il est nécessaire de faire toutes ces manœuvres rapidement; autrement, le liquide s'écoule, les éléments éciulés reviennent sur euxmêmes, et l'injection n'a produit aucun effet utile. Il faut donc disposer, avant do procéder à l'injection, une lame et une lamelle bien nettoyées, avoir sous la main ses instruments, de manière h

METHODES DE DlSSOCIATIOiN. 75

Élire la coupe et à appliquer la lamelle immédiatement. Une fois que la lamelle est placée, la capillarité la fixe et empêche les parties de se déplacer.

Quand on injecte de la gélatine, on peut aller plus lentement. Lîi gélatine se solidifie et maintient les éléments dans la situation que leur a donnée l'injection.

■•jciM cMmUivcs. — 11 y a ceilains réactifs qui, conservant ou même augmentant la solidité de quelques éléments, ramollissent ou dissolvent les autres, de telle soi1c que les premiers peuvent ensuite être très-facilement séparés.

Au nombre des réactions dont il s'agit ici, on peut ranger les premières modifications chimiques qui se passent au sein des tissus après la mort. Ainsi, si Ton sacrifie un animal et que Ton expose Fépithélium de l'intestin à Tair pendant seulement quelques minutes, les cellules épithéliales s'en détachent, il se produit un liquide lactescent dans lequel on peut voir ces éléments isolés.

Un procédé analogue consiste à abandonner les tissus à euxmêmes dans un espace clos. L'objet est mis dans un petit baquet sur une lame de glace dépolie et recouveile d'une cloche rodée. A côté du baquet est placé un petit niorcf»au de camphre, ou un peu de papier à filtrer trempé dans d(^ l'acide phénique à i pour 10. Si l'on a pris le tissu frais, il peut rester ainsi plusieurs jours sans se putréfier; mais il faut pour cela cpie le tissu soit tout à fait frais et ne contienne pas de germes de putréfaction, des bactéries par exemple, autrement ces moyens .seraient tout à fait insuffisants. Les tissus ainsi conservés subissent une sorte de macération qui rend les éléments plus facilement isolables.

Ce procédé est suilout à appliquer pour les tumeurs. Ainsi les épithéliomes tubulés sont composés de cellules soudées intimement les unes aux autres, et il est très-diflicile d'en détacher à l'état frais. Si on les abandonne sous une cloche, comme nous venons de le dire, on réussit, au bout de vingt-(|uatre heures, en raclant simplement la surface, à obtenir isolées un grand nombre de cellules avec des dentelures, cellules qui étaient fortement adhérentes les unes aux autres à l'état frais.

Certains réactifs liquides employés depuis quelques années ont donné pour la dissociation de fort heureux résultats. C'est une , métliode dont l'initiative est due ii Max Schuitze.

Alléraliou cadaTériqw.

Hmu»

abandooiié»

à aix-mème»

en yue dot.

7« THAITK TKi:H.MQLE 1) HISTOLOGIE.

Sémm iodé, — (le réactif, inventé par Max Schullze *, a lendu de grands servirc^s à l'histologie. Pour le fabriquer, on fait usage soit du sérum naturel du sang ou de l'amnios, soîl d'un séium fait avecr du blanc, dVeuf, de l'eau et du sel marin. Il n'y a qur» le sérum ftibriqué avec Teau de Tamnios des mammiféies <(ui présente des avantages sérieux -. O liquide est recueilli à rélat frais dans im ilacon au fond duquel on ajoute des paillettes d'iode. Il faut agiter tous les jours le mélange, ou ristourner le Ilacon, pour qur» l'iode se mélangea toute la masse; autrement il ne se trouveiait de l'iode qu'au fond du flacon, et à la partie supérieure se formeraient des vibrions et des bactéries.

^"rwidé» j^e meilleur procédé pour avoir un bon sérum iodé consiste

tur fabnquer ' «

l'iodé *^ '** préparcii* dans un flaion ((ui ne soit pas trop grand ou qui soit trés-plat, de manière» que le niveau du liquide ne dépasse pas "i à r] centimètres, de telle façon ([u'il ne puisse pas y avoir une couche considérable» de sérmu au-d<'ssus dr la couche plus fortement iodée du fond.

On peut aussi employer un autre» piocédé. Le sérum est mélangé avec une forte proportion de t(»intur(^ d'iode; il se» forme un précipité d'iode, on filtre» (»l l'on a luie solution fort«»ment iodée. On v(»rse tous l(»s deux ou trois jours un peu de cette» solution follement iodée dans le» sérum oi'dinaire, qui est ainsi présen'é de la |»utiéfaction. Il est à ri'uiarepier qu'au début, l'iode se dissout très-lentement dans le» sérum; mais si l'on continue son adion, une partie de cet iode» ne» tarde» pas (au bout de» quinze jours à trois semaines) à se transforme»r en iodures; e'e»s iodure?s contribuent alors à dissoudre une nouvelle (piantité d'iode, et par suite ou peut avoir au bout d'un a de»ux mois un sérum tre\s-foi1emenl iodé, (i'est ce sérum très-forte»ment iodé et présentcint unee*ouleur brun foncé qui est le meilleur liquide» pour ioder un sérum frais.

Il est ne»e'essaire d'avoir dans un laboratoire» diflérents sérums,

' A/. St:huilze^ Die Anwenduiif!^ mit lod consenirter thierischer Fliissigkeiten als iiiacerirendes und conscrvirendes Mitlel bel histologischen Untersuchuugen {Vtrchoir's Archiv.y 1864, vol. XXX, p. 263).

^ Pour se procurer de Ceau de rainnios, on va dans un abattoir de Paris demander <le8 gosstflins de veau ou de mouton (c'est le nom sous lequel est connu l'utérus (gravide). Une incision comprenant la paroi utérine et les membranes donne issue à un jet de sérum que l'on reçoit dans un flacon muni d'un entonnoir. O liquide doit «Hre |)arfaitcinent limpide et d'un jaune citrin. .

plus ou moins fortement iodés ; on se sert des uns ou des autres suivant les effets variés qu'on désire obtenir.

Pour délerminei' Faction dissociatrice du sérum iodé sur un tissu, il faut prendre un fragment du tissu à étudier inférieur au volume d'un pois, et le placer dans un flacon bien bouché avec 4 ou 5 centimètres cubes de sérum faiblement iodé ; généralement dès le lendemain, on peut pratiquer la dissociation par les moyens généraux indiqués plus haut. Si le tissu n'est pas encore asst»z ramolli, il faut prolonger son séjour dans le sérum iodé; maison remarque que, dès le second jour, ce sérum est tout à fait décoloré, c'est-à-dire que le tissu a absorbé tout l'iode ipfil contenait, et si on laissait les choses en l'état, la putréfaction ne tarderait pas à survenir. Pour l'empêcher, on ajoute quelques gouttes de sérum fortement iodé jusqu'à ce que le liquide ail repris une légère coloration brun(». Le séjoui* du tissu dans le sérum peut ainsi être prolongé pendant plusieurs semaines sans que la putréfaction survi(»nne, si l'on ajoute du sérum iodé chaqu(î ibis que le liquide se décolon». C'est l'addition successive de nouvelles quantités d'iode qui constitue la clef de cette méthode de dissociation.

Frey ' a préconisé le sérum artilieiel suivant :

Eau distillée 135 gram.

Albumine de l'œuf 15

Chlorure de sodium 0 »' 20

Mélangez, filtrez, et ajoutez :

■ Teinture d'iode 3 gram.

Ija mélange précipité, on (illre de nouvhau sur de la flanelle, et Ton ajoute au fond du vase quelques paillettes d'iode. Nous n'avons jamais réussi à oblenir par c(» j)rocédé un sérum iodé convenable.

Alcool cf eau. — D'autres léaclifs dissocient les tissus en ramollissant certains éléments, tandis qu'ils rendent les autres plus solides. Ainsi, un mélange de 1 partie d'alcool à :J() degrés (ît de 2 parties d'eau constitue un moyen de dissociation excellent, par exemple pour les épilhéliums. En laissant un intestin de grenouille plongé pendant vingt-quatre heures dans ce liquide, on obtient des cellules épithéliales isolées d'une netteté admirable.

* Frey, Das Mikroskop und die mikroskopische Technik, 1871, p. 70.

Manière d'employer le sénim iodédans les dissociations.

Sérum artificiel.

Kmploi lie ralcool.

11 réussit aussi bien chez les maiTunifùres, pour la plupart des épithéliunis et même d'autres éléments. Nous aurons roccasion d'v revenir dans la suite.

Acide chromique, — A la dose de â à 3 pour 10000, cet acide constitue un excellent liquide dissociateur, recommandé par M. Schuitze* ; il est très-bon pour la plupail des tissus de l'organisme, et en particulier pour les cellules nerveuses. 11 en faut prendre 10 centimètres cubes pour un fragment d'environ 5 millimètres de côté. Au bout de vingt-quatre heures de séjour dans ce liquide,le tissu nerveux se dissocie avec facilité.

Bichromate de potasse. — Il s'emploie à des doses dix fois plus considérîibles, à 2 à 3 pour 1000.

Potasse et soude. — Ces alcalis s'emploient en solutions fortes, de 35 à 50 pour 400 (Moleschott); ils dissolvent la substance intercellulaire en ne modifiant que légèrement les cellules, ce qui permet d'isoler ces dernières. On fait agir ces solutions de potasse directement sur la lame de verre où le tissu est étalé. On n'obtient pas ainsi des préparations durables ; au bout de quelque temps il survient de si grandes altérations, qu'on ne peut plus rien apercevoir de net.

A doses faibles, au contraire, comme l'a indiqué Moleschott, ils tlétruisent tous les éléments. On emploie des solutions faibles «le ces alcalis pour dissocier les éléments cellulaires des ongles, des poils et de l'épiderme.

Acide suif urique. — Concentré et à chaud, ce réactif peut être employé pour isoler les cellules des parties cornées,, des poils, des ongles, etc.

Pour isoler les fibres du cristallin, M. Schultze place cet organe dans 30 grammes d'eau additionnée de 4 ou 5 gouttes d'acide sulfurique concentré. Au bout de vingt-quatre heures de macération, il suffit d'agiter un fragment du cristallin dans le liquide pour le voir se décomposer en ses éléments constituants.

Acide azotique. — C'est Kôlliker ' qui a employé le premier cet acide; il s'en est servi à la dose de 20 pourJOO pour isoler les fibres musculaires.

Un petit fragment d'organe qu'on suppose contenir des fibres

1 M. SchultzCy Untersuchungen iiber den BauderNasenchleimhaut, etc. Halle, 1862. ' Voyez les indications données dans Kôlliker^ Éléments d'histologie, traduction française, 1868 ,p. 115.

musculaires lisses, placé dans 5 à 10 centimètres cubes de ce réactif, se laisse, au bout de dix-huit à vingt heures, dissocier avec la plus grande facilité au moyen des aiguilles.

Kûhne * a indiqué une méthode où Tacide azotique joue un rôle . Il fait, dans un verre de niontns un mélange de chlorate de potasse avec quatre fois son volume d'acide azotique; une fois le mélange bien homogène, on y enfouit à Taide d'une baguette de verre un fragment musculaire frais; après une demi-heure environ, il en est retiré, et, en l'agitant dans un tube rempli d'ciau distillée, le muscle se sépare en ses éléments.

Réactifs divers, — Plusieurs auteurs ont essayé de combiner Taction de divers réactifs avec celle de la chaleur.

Ludwig - a proposé, pour dissocier les éléments glandulaires du tein,de chauffer les tissus pendant six à huit heures dans de l'alcool à iO pour 100, auquel on ajoute 1 pour 300 ou 1 pour 400 diacide chlorhydrique concentré. On chauffe au bain -marie dans une cornue convenablement disposée pour éviter le dégagement des vapeurs acides; ensuite le tissu est mis à macérer dans Teau distillée pendant plusieurs jours, jusqu'à ce que, par l'action la plus légère des aiguilles, on arrive à séparer les tubes urinifères.

Rollett a employé la coction en vase clos dans une petite quantité d'eau. I^ tissu est mis avec un peu d'eau dans un tube scellé à la lampe que Ton chauffe jusqu'à 1^5 ou 130 dégrés dans un bain de sable. Tout le tissu collagène se transforme en gélatine; letube est alors brisé dans l'eau chaude, qui dissout la gélatine «'t permet la séparation des auties éléments.

CoHiprcusioii. — Nous nc citcrous que pour mémoire ce moyen de dissociation à peu près abandonné parles hislologistes, et qui était employé autrefois par les zoologistes qui se servaient du microscope. En histologie, la compression est plutôt à éviter.

Quoi qu'il en soit, ce procédé consistr» à comprimer la préparation, lorsqu'elle est en place, au moyen d'une pression exercée par la lamelle. Ce moyen a joui d'une assez grande faveur pour qu'on ait inventé des compresseurs divers. Schick, de Berlin, a fabriqué le premier de ces instruments. 11 se compose d'un anneau de laiton venant s'appliquer sur une lame de verre soutenue pai-

* Kûhne, Ueber die peripherischen Endorgane der molorischen Ncrven. Leiptig, 1862.

' C. Ludwig^ von der Miere. {Stricker*s Handbuch, p. 506.)

une plaque do laiton percée d'un trou correspondant à Tanneau. Celui-ci est maintenu appuyé par un ressort qu'on peut modérer au moyen d'une vis. On mot la préparation et la lamelle entre l'anneau et la lame do verro.

Ce procédé n'est plus en usage aujourd'hui.