L. ROGERS, Proc. of thc Roy. Soc, 4 mai

2. A. Laveran et F. Mesnil, C. R. Soc. Biologie, 6 oct. et 10 nov. 1900.

270 TRYPANOSOMES ET THYPANOSOMIASES

49, 50, 51, 52 jours. Francis, dans les mêmes conditions, en a gardé vivants 81 jours.

Au sortir delà glacière, les mouvements des trypan. sont toujours ralentis, ils s'accélèrent quand le sang se réchauffe. Mais, à mesure que le temps s'écoule depuis la mise à la glacière, le nombre des trypan. vivants va graduellement en diminuant. De plus, ceux qui sont encore vivants ne montrent plus la vivacité initiale. Ils apparaissent, à l'examen à l'état frais, comme nettement granuleux. De grosses granulations se forment chez les trypan. qui sont à la glacière depuis 15 jours ou plus; ces granulations se colorent comme le centrosome et atteignent souvent le volume de ce dernier; leur nombre et leur disposition sont variables. La figure XXXIV(13 et 14j représente deux trypan. colorés après un séjour de 20 jours à la glacière.

Enfin, un autre phénomène apparaît, souvent déjà après 2 ou 3 jours de séjour à la glacière : c'est celui de l'agglomération des trypan. soit par 2, soit en nombre variable; l'union se fait toujours par les extrémité postérieures; on a ainsi des rosaces et, comme les trypan. ont conservé leur mobilité, chaque élément de la rosace continue à se mouvoir, en agitant son flagelle et sa membrane ondulante. A mesure que la durée du séjour du sang à la glacière augmente, le nombre des trypan. libres diminue ; mais, à côté des parasites agglomérés, on trouve presque toujours quelques parasites libres, même après un mois et plus. (Pour les détails du phénomène, voir infra).

Des échantillons de sang à trypan. conservés à la glacière depuis 44, 47, 51, 52 et 53 jours se sont montrés encore virulents; la période qui précède l'apparition des trypan. dans le sang des rats inoculés a seulement été plus longue {voir supra).

La durée de conservation est beaucoup diminuée si le sang n'a pas été recueilli avec pureté et si des bactéries s'y développent en grand nombre.

Cette longue conservation à la glacière du Tr. Leivisi constitue une des caractéristiques lés plus curieuses de cette espèce. Elle permet de la distinguer et au besoin de la séparer des espèces pathogènes du type Brucei. Il y aurait lieu d'étudier à cet égard les autres trypan. non pathogènes. Nous verrons plus loin que Pétrie a constaté que le trypan. du lapin se gardait vivant un mois à la glacière.

C. et R. Biot et Richard ', ayant remarqué que, dans les cadavres de rats infectés, le trypan. se conservait vivant le plus longtemps dans le foie, surtout quand la température est basse, ont émis la supposi-

I. C. R. Biot el Richard, C. F(. Soc. Biologie, t. LXXI, 1911, p. 368.

TRYPANOSOMA LEWISI

lion que le glucose joue un rôle dans la conservation in vitro du Tr. Lewisi. A 0% précisément, il n'y a pas gLycolyse du sucre du sang (CI. Bernard). Les auteurs ont mis en lumière le rôle du glucose en ajoutant ce sucre à des ampoules fermées contenant du sang citrate avec Tr. Lewisi; dans ces conditions, à 17°, les trypan. restent vivants plus de 10 jours, alors qu'ils meurent en 4-5 jours dans les ampoules témoins,

A 37", d'après Jiirgens, les trypan. ne vivent que 2-4 jours. Nous avons constaté qu'ils supportent assez bien une température de 41°. A 50", les mouvements se ralentissent rapidement et, au

11. Trypan. dans le sang frais du cobaye, v, corpuscule réfringent. — 12. Trypan. dans une préparation colorée du sang de cobaye, c, ccntrosome, i-, vacuole. — 13 et 14. Trypan. colorés après un séjour de 20 jours à la glacière. — 15. Trypan. déformé après être resté 9 jours en goutte suspendue (sang et sérum de poule}. — 16. Ccntrosome et flagelle, reliquat d'un trypan., dans une préparation colorée.

bout de 5 minutes, on ne voit plus aucun trypan. mobile. Jiirgens a pourtant vu des trypan. supporter, sans perdre leur caractère infectieux, un chauffage de 2 heures à 50% suivi d'un refroidissement lent; ils ne supportent plus le même chauffage à 58".

D'une façon générale, on peut dire que les Tr. Lewisi sont sensibles aux températures supérieures à 40'; mais ils le sont certainement moins que les trypan. du type Briicei.

Les Tr. Lewisi sont susceptibles de supporter de basses températures. Ainsi Jurgens a conservé des trypan. vivants entre — 5" et — 8" pendant au moins 7 jours en préparations microscopiques. Quand il réchauffait ce sang pour l'examen journalier, il notait que la mobilité des trypan., d'abord nulle, revenait peu à peu.

Le même savant a vu que le sang, maintenu 2 heures à — 17°, n'était plus infectieux. Nous avons répété cette expérience dans des conditions à peu près identiques. Un tube de sang citrate de rat a été placé pendant 2 heures dans un mélange de glace et de sel marin ; la température du mélange a varié de — 15°, 5 à — 18°, 5. Au bout de ce temps, nous avons constaté, dans le sang réchauffé, que la

272 TRYPANOSOMES ET TIIYPANOSOMIASES

plupart des trypan. étaient immobiles, mais nous en avons vu quelques-uns de bien mobiles. 1/2 ce. de ce sang, inoculé dans le péritoine d'un rat, a donné à l'animal une infection intense après 6 jours 1/2 d'incubation.

Notons enfin que le Tr. Leivisi est capable de résister un certain temps à la température de l'air liquide. Du sang citrate, porté 15 minutes à la température de — 191 " (une minorité seulement des trypan. étaient restés mobiles, les autres étaient généralement bien conservés, souvent granuleux), a infecté un rat, à la dose do 1/3 ce. dans le péritoine (incubation 3 jours; infection intense). Le même sang, porté 13 minutes à — 191°, puis réchaulTé, et ensuite soumis de nouveau pendant 1 heure à l'air liquide (à l'examen microscopique du sang, on trouvait difflcilement un trypan. mobile), a infecté un rat, toujours à la dose de 1/2 ce. dans le péritoine (incubation 6 jours; infection intense). Du sang soumis 24 heures à l'air liquide n'a montré que des trypan. en boule et n'a pas été infectieux.

Action de diverses radiations. — Des Tr. Lewisi, en goutte pendante, ont été soumis à l'action du radium (10 mgr. de bromure de radium obligeamment prêtés par M. le D"" Rehns) à travers le verre de la lamelle couvre-objet et la lame de mica qui fermait le récipient contenant le radium. Plusieurs expériences nous ont prouvé qu'il fallait 12 heures environ pour faire perdre aux trypan. leur mobilité. Ils sont donc plus sensibles que les bactéries.

En revanche, Lœwenthal et von Rutkovvski', dans les mêmes conditions, n'ont pas obtenu de résultats. Avec les rayons de RiJntgen demi-mous, ils ont obtenu en 30 minutes une action nette qu'ils ne peuvent rapporter à réchauffement. Les trypan. des diverses préparations se sont montrés, pour des raisons qui n'ont pas été éclaircies, très inégalement sensibles, mais leur sensibilité peut être généralement regardée comme considérable vis-à-vis de celle des autres protozoaires. Les trypan. modifiés par l'influence des rayons deviennent immobiles et leur réfringence diminue beaucoup. Les individus immobiles sont courbés en croissant. Lorsque les trypan. ne deviennent pas complètement immobiles, ils ont toujours une vacuole située en avant du blépharoplaste. Les individus immobilisés ne sont pas toujours morts et peuvent retrouver spontanément leur mobilité (après 10-20 min. par ex.) si l'action n'a pas été trop prolongée ou répétée.

Les résultats in vivo ont été nuls.

CuLTiRE. — Dans tout ce qui précède, il s'est agi seulement de ■conservation du Tr. Lewisi. Nous allons maintenant examiner comment on peut réaliser la culture de ce Irypanosome. A diverses

1. Lœwenthal et von Rutkowski, Ther. der Gcgenwart, sept. 1907.

TRYPANOSUMA LEWISl 273

reprises, certains auteurs ont prétendu avoir obtenu, accidentellement ou non, le développement in vitro de trypanosomes variés; mais les résultats sont restés plus que douteux jusqu'aux recherches de Novy et Me Neal.

Nous avons, dans le chapitre de Technique, indiqué dans quelles conditions la culture des trypan. peut être réalisée. Xous n'y revenons pas ici.

Le Tr. Lewisi est le premier trypan. dont la culture a été obtenue. Elle est relativement facile dans l'eau de condensation du milieu gélose-sang de Me Neal et Novy; on réussit presque toujours, à condition d'ensemencer plusieurs tubes à la fois, à obtenir une culture en partant du sang d'un rat infecté et les ensemencements de tube en tube se font également assez bien.

D'après Me Neal et Novy, le Tr. Lewisi pousse dans des milieux avec 1 de sang pour 3 et même 10 de gélose. Mais il préfère les milieux riches en sang; la proportion optima paraît être 2 de sang pour. 1 de gélose. Dans leurs premières i^echerches, les savants américains ont surtout employé un milieu renfermant 1 de sang pour 2 de gélose.

A la température du laboratoire, le développement est assez lent, surtout si le milieu a été faiblementensemencé. Au bout d'un certain temps, on voit, à côté des trypan. isolés, des rosaces qui deviennent de plus en plus nombreuses et qui sont souvent formées d'un grand nombre d'éléments (il peut y en avoir jusqu'à mille]. Tous ces trypan. sont bien mobiles. Plus tard, le nombre des trypan. vivants diminue; on trouve, au centre des rosaces, de nombreuses boules provenant de la dégénérescence des trypan. Finalement tout meurt. Ce terme final est atteint au bout d'un temps variable qui — quand le milieu est récemment préparé et que l'ensemencement a été faible — peut être de plusieurs mois. En modifiant le milieu type que nous avons décrit et qui est celui qui a servi pour les passages en série, Me Neal et Novy sont arrivés à garder des trypan. vivants dans un même tube jusqu'à 306 jours.

Le milieu, dans ce cas, se composait de deux parties d'agar, une partie de sang de rat et une partie d'une solution renfermant du glycocolle à 1 p. 100 et de l'asparaginate de sodium également à 1 p. 100; après refroidissement du tube, du sang défibriné de lapin était ajouté à l'eau de condensation. Le sang défibriné de lapin paraît d'ailleurs constituer, à lui seul, un excellent milieu pour la culture et la conservation du Tr. Lewisi. Enfin, on obtient encore de bons résultats en utilisant des tubes tout préparés de gélose ordinaire inclinée, à l'eau de condensation de laquelle on ajoute du sang défibriné.

A la température du laboratoire, Me Neal et Novy ont réalisé, du

Ijaveran et Mesnil. — Trypanosomes et Trypanosomiasos. 18

46 mai 1902 au 19 mai 1903, une série de 11 passages de tube en tube (milieu avec 2 de gélose pour 1 de sang défibriné). Un peu de culture du dixième tube de passage, inoculé dans le péritoine de deux rats, les a infectés après quatre jours d'incubation.

A la température de 34-37°, la culture est plus rapide; elle présente les mêmes phases que celle faite à la température du laboratoire. Elle atteint son maximum en 8 à 12 jours. Après 15-20 jours, tout est mort. Me Neal et Novy attribuent cette mort rapide à la transformation, également rapide à l'étuve, de l'hémoglobine en hémaline.

Du 4 décembre 1902 au 23 mai 1903 (soit 170 jours), M. N. et N. ont réussi à obtenir à l'étuve 22 passages de tube en tube. II convient de remarquer que les septième et neuvième tubes de passage ont cultivé à la température de la chambre : le tube 6 ayant été porté accidentellement à 40° quelques heures, les trypan. qu'il contenait sont entrés rapidement en dégénérescence; et les réensemencements, pratiqués dès qu'on s'est aperçu de cette dégénérescence, n'ont pas réussi à 35^^ mais seulement à la température de la chambre. Le tube du huitième passage, placé à 37°, y a peu prospéré et le tube du neuvième passage, placé à létuve, n'y a pas cultivé du tout; il a donc encore fallu prendre un tube du neuvième passage développé à la température du laboratoire.

Ces détails montrent nettement combien les trypan. en culture supportent mal des températures égales ou supérieures à 37".

Des trypan. de trois tubes du vingtième passage ont été inoculés à des rats : un des rats n'a contracté qu'une très légère infection, mais les deux autres ont montré des trypan. dans leur sang après 0-6 jours d'incubation; l'infection a été très intense et ils ont succombé l'un et l'autre. Me Neal et Novy ont vu aussi que, de deux tubes de dixième passage à l'étuve, l'un (milieu alcalinisé) n'a pas déterminé d'infection chez le rat, l'autre (milieu ordinaire, non alcalinisé) a donné une infection normale. Il est impossible de tirer de ces faits une conclusion ferme, car rien ne prouve que les rats qui ont résisté n'étaient pas naturellement réfractaires.

En 1907, Novy' notait qu'après deux ans de conservation en culture, les Tr. Lett>/s/ étaient toujours virulents.

De notre côté, nous avons donné une infection légère à un rat avec une culture de 22 jours, à 20», du deuxième passage. Nous avons donné à deux rats une infection très intense en leur inoculant dans le péritoine à chacun une goutte d'une première culture vieille de 35 jours et où, depuis une dizaine de jours, s'était développée une abondante flore avec bactéries et moisissures variées.

Smedeley ^ a pu, en l'espace de 9 mois, obtenir 9 passages succes-

1. Novy, Proc. Soc. for exp. Biol. a. Med., t. IV, 1907, p. 42.