CULTURE DE DIVERS ORGANISMES A L’ÉTAT DE PURETÉ. LEUR AUTONOMIE

Les observations du Chapitre précédent nous ont appris que les liquides organiques naturels ou artificiels, le moût de bière entre autres, exposés au contact de l’air, ne tardent pas à nourrir des productions diverses.1 C’est une conséquence naturelle du mode d’ensemencement. La fécondité du liquide dépend des semences microscopiques variées que l’air commun y dépose et dont la nature et le nombre résultent de l’emplacement du vase, de sa hauteur au-dessus du sol, de la saison, de l’agitation de l’atmosphère, etc.

L’association fortuite de productions diverses dans des cultures qu’on peut croire uniques et indépendantes constitue une des principales difficultés de l’étude des organismes inférieurs, particulièrement des moisissures. Les germes de beaucoup de ces petits êtres se trouvant dans l’atmosphère sous forme de poussières invisibles à l’œil nu ou répandues à la surface des matières et objets divers qu’on utilise pour les expériences, l’observateur est à chaque instant exposé à interpréter d’une manière erronée les résultats qui passent sous ses yeux. Il a semé une plante, il en suit les développements; à son insu, les spores d’une autre se sont mêlées à ses cultures et ont germé.

1. Je combats dans cet Ouvrage, par des preuves expérimentales que je crois irréfutables, les opinions de plusieurs auteurs au sujet de certaines transformations du pénicillium glaucum en levûre ou en mycoderma, des bactéries en levûre lactique, de la levure en vibrions, du mycoderma aceti en levûre, etc... Toutefois, je ne me prononce point a priori sur la question de savoir si les organismes inférieurs dont il va être parlé dans ce Chapitre, y compris lés levûres et les ferments proprement dits, sont des êtres complets dans leur forme habituelle ou s’ils sont susceptibles de polymorphisme; c’est sous cette réserve que j’emploie le mot autonomie. Quand j’invoquerai pour une espèce son polymorphisme, ce ne sera pas sans en fournir les preuves. Des organes détachés d’organismes plus élevés, des êtres à une certaine phase de leur vie, peuvent se régénérer sous une forme déterminée avec des propriétés spéciales dans des milieux et dans des conditions qui ne sauraient faire apparaître la plante ou l’animal avec ses autres formes ou modes habituels de reproduction. Les exemples de ces faits abondent aujourd’hui dans la science. Certaines levures alcooliques nous offriront des faits analogues ; mais vouloir étendre ces résultats prématurément et admettre un polymorphisme qAon ne saurait montrer, par cela seul qu’on le juge possible ou sur la foi d’observations confuses, c’est se livrer gratuitement à l’esprit de système. ,

Comme il l’ignore, il rapporte tout ce qu’il voit, toutes les transformations qu’il décrit et qu’il dessine, toutes les déductions auxquelles il est conduit à la seule plante qui le préoccupe. Plus grand encore est l’embarras quand il s’agit des bactéries, vibrions et généralement de tous les petits êtres qui se déplacent. Enfin, le milieu qui sert de substratum aux cultures ayant une influence considérable sur la fécondité des germes, aussi bien que sur leur développement ultérieur, il arrive fréquemment que ceux de ces germes qui sont fortuitement déposés par les poussières tombées de l’atmosphère ou recueillis sur les objets sont féconds et de facile multiplication, tandis que ceux qu’on a semés directement, quel qu’en soit le nombre, restent stériles ou d’une propagation moins rapide. Déposez sur du vin jeune du mycoderma aceti , vous recueillerez du mycoderma vini ; déposez du mycoderma vini sur du vin vieux, surtout s’il est un peu acide, vous recueillerez du mycoderma aceti (4). C’est par des faits de cette nature, mal interprétés, que beaucoup d’erreurs se sont introduites dans la connaissance des organismes inférieurs, et qu’on voit renaître sans cesse des discussions, soit au sujet des générations dites spontanées , soit au sujet des théories sur la fermentation. A chaque pas, dans le cours de cet Ouvrage, nous trouvons la trace de ces complications, comme aussi des conséquences qu’elles ont eues sur le progrès de nos connaissances.

Par opposition à ces résultats, nous étudierons ce qui arrive à du moût de bière qu’on ensemence directement avec une semence unique sans mélange d’aucune autre.

§ I- — Culture du pénicillium glaucum et de Z’aspergillus glaucus à l'état de pureté. — Preuves que ces moisissures ne se transforment pas en levures alcooliques de la bière ou du vin. — Premières vues au sujet de la cause de la fermentation.

Pieprenons notre ballon à deux tubulures de la page 29, contenant du moût sucré, lequel n’aura éprouvé, depuis le moment de sa préparation, que nous pouvons supposer déjà éloigné, aucune altération quelconque, si ce n’est toutefois une oxydation lente qui a fait brunir progressivement la couleur du liquide. Il s’agit de .faire tomber dans ce liquide, non altéré et toujours fécond, des graines ou spores de

T j oir, à ce sujet, mes « Études sur le vinaigre », Paris 1868; par exemple, la note de la page 7b [note 2, p. 47-49, tome III des Œuvres de Pasteur] ; et surtout mes « Études sur le vin », 2° édition, Paris, 1873, page 19 [p. 130-131, tome III des (Eüvres de Pasteur],

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pénicillium, dépourvues de tout mélange avec des spores ou germes d’autres organismes microscopiques.

Un moyen d’y parvenir consiste à prendre au bout d’une pince métallique, préalablement chauffée, un fragment de fil de platine de 1 centimètre ou 2 centimètres de longueur, qu’on fait passer également dans la flamme de la lampe à alcool et avec lequel on touche, aussitôt qu’il est refroidi," un amas de sporanges d’une culture de pénicillium. Si peu que l’extrémité du fil de platine prenne de spores, elle en portera dans le liquide bien au delà de ce qui est nécessaire pour l’ensemencement. Au moment même où l’on charge la pointe du fil, on enlève le bouchon de verre qui ferme le tube de caoutchouc de la tubulure droite du ballon, et on laisse tomber le fil par cette tubulure ; puis on remet en place le bouchon de verre après l’avoir, par surcroît de précaution, fait passer rapidement dans la flamme de la lampe. Sans doute, on ne peut éviter ainsi la cause d’erreur qu’entraîne cette nécessité du passage dans l’air ambiant et celle de l’ouverture préalable du ballon ; mais j’en ai déjà fait la remarque, cette double cause d’erreur n’a, pour ainsi dire, jamais été préjudiciable à la rigueur des expériences, parce qu’elle s’exerce en définitive sur un volume d’air excessivement restreint et que, le ballon étant en libre communication avec l’air extérieur par l’ouverture du tube recourbé effilé, il n’y a pas de rentrée d’air quand on ôte le bouchon. La chance que l’on aurait de rencontrer une spore ou un germe fécond, que le fil porterait dans le ballon en même temps que ceux dont il est chargé, est si peu fréquente que je n’ai trouvé aucune utilité à adopter un dispositif opératoire plus sûr, lequel à la îigueui aurait pu être facilement imaginé si la nécessité s en était fait sentii .

La manipulation qui précède donne lieu à une cause d erreur plus sérieuse : c’est celle qui résulte de l’impureté possible de la semence quand on la prend dans un champ de graines de pénicillium, dont le développement s’est fait au contact de l’air ordinaire. Ce champ reçoit à chaque instant et a reçu, depuis qu’il est en culture, des poussières tombées de l’atmosphère ; il ne saurait donc être et n’est réellement pas exempt d’autres graines de moisissures (4).

1. Certaines observations du Chapitre précédent permettent de se rendre compte du nombre considérable de germes qui tombent sans cesse à la surface de tous les objets , e aïs ici allusion à l’usage que nous avons fait de ces ballons de la forme ci- contre (fig. 17), d une capacité de 250 centimètres cubes à 300 centimètres cubes, remplis au tiers de leur volume d’un liquide organique, qu’on a fermés en pleine ébullition, qui sont par conséquent vide d’air après leur refroidissement et qu’on va ouvrir par séries de 10, 20, 30, etc en Pjeiû air, pour les refermer aussitôt. Cette manipulation enferme dans c acua 1 eux env“ ~ mètres cubes d’air avec tout ce que ce volume d’air contient de poussières e suspension, puisque, par l’effet de la suppression brusque du vide intérieur, lair se précipité foice.

L’opéraleur, à son insu, pourra semer fréquemment, outre le pénicillium seul apparent, des spores de mucor muceclo , de mycodevma vini , de toutes les moisissures les plus ordinaires en un mot.

Ce procédé d’ensemencement n’offre donc pas de garanties suffisantes. On le rend plus rigoureux en recourant à un artifice.

Prenons une série de ballons de la forme (fîg. 17), contenant un liquide organique propre au développement des moisissures, c’est-à-dire légèrement acide : eau de levûre, eau de levure sucrée, moût de bière, liquide Raulin (4), etc. ; faisons bouillir le liquide et, après avoir étiré le col, fermons à la lampe pendant la sortie de la vapeur, au moment où l’on juge que l’air est à peu près chassé. Préparons ainsi dix, vingt de ces vases. Après le refroidissement, brisons leurs pointes dans un lieu quelconque. L’air rentre avec force dans ces ballons ; refermons-les à la lampe et attendons : bref, c’est une méthode de culture qui nous a déjà servi. Dans un certain nombre de ces ballons, ainsi que nous l’avons expliqué, nous verrons apparaître des moisissures, d’abord sous forme

Fig. 17.

Or, on constate toujours qu'un certain nombre de ces ballons s’altèrent avec le temps, et l’on remai que que la proportion de ceux qui s altèrent et la nature de l’altération sont en correspondance parfaite avec ce que l’on peut présumer du nombre et de la nature des germes en suspension propres à se multiplier dans le liquide nutritif employé. Opère-t-on à une grande hauteur, loin des habitations, loin des souillures des villes, des plaines habitées, comme je 1 ai lait au Montanvert, près de la Mer de Glace [Voir, à ce sujet, tome II des Œuvres de Pasteur, p. 274-27/ . Expériences sur 1 air à diverses hauteurs], l'altération est des plus rares- Dans une chambre habitée de la petite auberge malpropre et mal tenue du Montanvert, les résultats furent opposés. Dans un laboratoire où l’on étudie les fermentations, on recueille certaines natures de germes, souvent autres que ceux de plein air en rase campagne. Enfin veut-on des organismes dans tous les ballons, on n’a qu’à faire soulever les poussières du sol ou des objets au moment où l’on ouvre les ballons. Cette expérience si simple, si facile à reproduire, nous dit clairement qu’il est impossible que le champ de sporanges d’une moisissure, lorsqu’elle est formée dans un vase non couvert ou à la surface d’un fruit, orange, citron, poire, etc., ne soit pas mêlé à des germes étrangers à la petite plante. En d’autres termes, un observateur qui sème des spores de 'pénicillium après les avoir recueillies, ici ou la, « avec un pinceau », s’expose à de graves causes d’erreur.

1. On sait que M. Jules Raulin a publié un travail remarquable sur la recherche du milieu minerai le mieux approprié par sa composition à la vie de certaines moisissures vulgaires et qui! a donne une formule de composition pour un tel milieu. C’est ce que j’appelle ici, par abréviation : liquide Raulin. ^ ’ *

Eau .

Sucre candi . ' ‘ ' ! .

Acide tartrique . .... .

Nitrate d’ammoniaque .

Phosphate d’ammoniaque . . .

Carbonate de potasse . . '

Carbonate de magnésie . ' , ' n’.

Sulfate d’ammoniaque . . . J?’*

Sulfate de zinc . . . JJ’jri

Sulfate de fer . . . . fj’VL

Silicate de potasse . . .

J. Raulin. [Études chimiques sur la végétation.] Paris, 1870, in-8°. (Thèse pour le doctorat ès sciences physiques.)

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de llocons de mycélium nageant dans le liquide, qui viendront ensuite fructifier à la surface. Or, il arrive souvent que le pénicillium glaucum apparaît seul, tant sont nombreuses les spores de cette moisissure qui flottent dans l’air. Nous aurons évidemment, dans de telles conditions, un champ de sporanges tout à fait sans mélange étranger. Détachons le col d’un de ces ballons à pénicillium pur et prélevons la semence avec notre lil de platine (*) : tel est le moyen le plus sûr de récolter

des spores de pénicillium exemptes d’impuretés.

Le lecteur excusera la longueur de ces détails et la minutie de toutes ces précautions. Nous aurons bien des occasions de reconnaître qu’en les négligeant, même en partie, il est difficile de déduire des faits observés des conclusions dégagées d’incertitude.

Le 17 juin 1872, on dépose des graines pures de pénicillium dans une série de trois ballons à moût de bière (fig. 18), en suivant toutes les indications prescrites.

Je désignerai ces ballons par les lettres A, B, C. Les jours suivants les spores semées germent, et le liquide se remplit de flocons de mycélium, dont quelques-uns viennent fructifier à la surface. La température est de 25° à 30°.

Le 22 juin, des îlots blanchâtres sur les bords, verts au centre, sont développés sur les liquides. Alors on agite le ballon A pour submerger la plante et les spores (-). Le ballon B est agité de même, mais après qu’on eut fermé à la lampe l’extrémité de son tube effilé, sinueux (1 2 3). Le ballon C est joint d’un côté à un aspirateur, de

1. Si l’on ne veut pas se livrer au hasard de ces ensemencements spontanés pour se procurer du pénicillium pur, en ouvrant puis refermant à la lampe un certain nombre de ballons à pointe effilée, on peut utiliser comme il suit un des ballons qui, après avoir été ouverts et refermés, n’ont donné aucune production organisée. On les ensemence directement en y laissant tomber, toujours sur un fil métallique, des spores prises dans une culture quelconque de pénicillium exposée à l’air ordinaire, et c’est dans le champ nouveau de spo • ranges formées par cette semence dans le ballon qui a été referme quon va puiser plus tant la semence pure dont on a besoin. Cette méthode est plus rapide et presque aussi sûre.

Je dois ajouter que, lorsqu’on veut prélever pour semence des spores de pénicillium dans un ballon fermé où la plante a fructifié, il ne faut pas attendre que celle-ci y ait séjourné trop longtemps. Après une durée de quelques jours à la suite de l'ensemencement, la moisissure est arrêtée dans son développement, parce que tout l’oxygène a été absorbé et quelle se trouve plongée dans un mélange d’acide carbonique et d’azote. Le séjour trop prolongé des spores dans cette atmosphère les fait périr toutes sans exception.

2. Pour agiter le liquide sans danger d’introduction de poussières extérieures, on passe d’abord la flamme de la lampe à alcool sur le col étiré du ballon, dont on ferme ensuite la pointe ouverte avec un trait de flamme; on agite alors sans crainte, puis on ouvre de nouveau la pointe effilée du col sinueux, afin de rétablir la communication avec l’air extérieur.

3. Le ballon B a été fermé à la lampe, parce que les expériences dont je parle ici avaient en partie pour but de contrôler celles de M. Trécul sur la transformation du pénicillium en levure. Chose assez bizarre, d’après M. Trécul, comme on va le voir plus loin, les spores pénicillium ne se transformeraient en levure qu’autant qu'on tiendrait « la fermeture pai laite » des vases où on les a semées.

1 autre a jun tube plein de coton, et tous les jours on renouvelle l’air du ballon.

Dans les semaines et les mois suivants, il ne s’est pas formé trace de levure de bière dans ces ballons. J’ai répété souvent ces expériences et d autres analogues. Dans aucun cas, je n’ai vu apparaître ni la levûre ordinaire, ni la fermentation alcoolique qu’elle détermine. On peut laire ces essais avec des jus sucrés très propres au développement des bactéries ou de la levure lactique. Ces dernières productions se montrent également non transformables en levûre. On ne voit jamais

Fig. 18.

celle-ci prendre naissance à leur suite quand on a soin de les cultiver a 1 état de pureté. Il n en est plus de même si l’on ne prend pas toutes les précautions indispensables pour opérer sur des spores tout à fait sans mélangé. Que l’on sème, par exemple, des spores de pénicillium qui a poussé au libre contact de l’atmosphère, par conséquent exposé aux poussières qu’elle charrie, on voit fréquemment apparaître, mêlés aux tubes fructifères de la moisissure, tantôt de la levûre de bière ou du 7 nycoclerma vint et des torulas, tantôt des bactéries ou de la levûre lactique, et l’observateur croit de bonne foi qu’il a sous les yeux toutes les transformations des spores de la moisissure en cellules de levûre, comme il peut croire également au passage ; des bactéries ou de la levûre lactique à ces mêmes cellules.

Ce sont des causes d’erreur de cette nature qui ont conduit divers

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naturalistes allemands à croire qu’ils avaient réussi à donner des preuves certaines qu’une foule de moisissures pouvaient faire naître la fermentation alcoolique, et qu’ils avaient manifestement démontré la transformation des spores de ces champignons en levûre de bière. M. Bail (J) en 1856, à la même époque Berkeley (2), plus tard H. Hoffmann (1 2 3), Hallier (4 5), ont partagé à leur tour cette opinion, introduite dans la science par M. Turpin. Je l’ai combattue dès l’année 1861 (Bulletin de la Société philomathique [3]). Depuis cette époque, elle a perdu plutôt que gagné du terrain à l’étranger, malgré la faveur croissante du système de Darwin. Un des mycologues qui jouissent, de l’autre côté du Bhin, de la plus légitime autorité, M. de Bary (6 7 8), est arrivé, comme moi, à des résultats absolument négatifs.

La simple lecture des écrits favorables aux transformations dont je parle inspire les doutes les plus sérieux sur la rigueur des observations qu’on y invoque comme décisives. Je n’en citerai qu’un exemple, emprunté à un Mémoire de M. H. Hoffmann :

« ... Mais, dit-il, dans quelques cas, j’ai pu, grâce à des circonstances favorables, voir le ferment produire des filaments soit en petits échantillons propres à être examinés immédiatement sous le microscope, soit en grands échantillons ; alors j’ai reconnu, entre autres espèces, le pénicillium glaucum , Y ascophora mucedo , Yascophora elegans et le periconia hyalina , tantôt isolés, tantôt mélangés. Voici la méthode par laquelle on obtient le plus aisément ce résultat. On verse quelques gouttes d’eau dans un tube à réactif qu’on place obliquement; on met ensuite, dans sa portion médiane, un peu de levûre fraîche, et l’on bouche le tube avec de l’ouate pour empêcher l’entrée des poussières extérieures. Dans ce récipient rempli de vapeur, on voit quelquefois naître des flocons. MM. Berkeley etG.-H. Hoffmann (7) ont obtenu aussi de fa levûre le pénicillium par le même procédé, à ce qu’il paraît ( » ). »

1. Bail (Th.). Ueber Hefe. Flora, XL, 1857, p. 417-430 et 433-444.

2. Berkeley (M. J.). Introduction to cryptogamie boiany, 1857.

3. Hoffmann (H.). Mykologische Studien über die Gâhrung. Botanische Zeitung, XVIII. 1860, p. 41-46 et 49-54. — Études mycologiques sur la fermentation. Annales des sciences naturelles (Botanique), 4e sér., XIII, 1860, p. 19-44.

4. Hallier (E.). Mitteilungen über Hefebildung. Botanische Zeitung , XXII T. 1865, p. 238-240: et XXIV, 1866, p. 60-61 et 285-287.

6. Bary (Anton de). Die neuesten Arbeiten über die Entstehung und Vegelation der niederen Pilze, insbesondere Pasteur’s Untersuchungen. Flora, XLV, 1862, p. 355-365; XLVI, 1863, p. 9-12. 16-25, 43-47. — Recherches sur le développement de quelques champignons parasites. Annales des sciences naturelles (Botanique), 4° sér., XX, 1863, p. 5-148.