CHAPITRE TI

Choix du ferment et technique opératoire.

Pour entreprendre cette étude il faut choisir un ferment dont la fonction chimique donne naissance à un produit bien défini et facile à doser.

La fermentation alcoolique et la fermentation lactique semble convenir parfaitement.

M. Biernacki, dans le travail qu'ila entrepris pourrechercher la dose accélétatrice maximum de divers antiseptiques s’est adressé à la fermentation alcoolique. Il mesurait les volumes d'acide carbonique dégagé, pendant un même laps de temps, par la fermentation d’une solution de glucose à 5 0/0, additionnée de son volume, soit d’eau distillée, soit d’une solution titrée de la substance qu’il voulait expérimenter, soumis à l’influence de 0 gr. 2 levure de bière fraîchement essorée.

Pour pouvoir comparer ces résultats, il ramenait les volumes des dégagements gazeux observés à la température de 0° et à la pression de 760 millimètres par la correction suivante :

Yu VV. (H—F) 7 760 (1+-0,0035 T) V’ étant le volume observé.

H, la pression atmosphérique au moment de l’expérien-

ce. CHASSEVANT 3

TS ee

F, la tension de la vapeur d’eau.

T, la température au moment de l'observation.

Il se contentait de noter la dose pour laquelle il observait le plus grand dégagement gazeux sans tenir compte de la valeur absolue de ces dégagements.

Dans des expériences comparatives faites avec la même levure dans un milieu qui ne contenait que du glucose. M. Biernacki a eu des différences entre les volumes minima et maxima d'acide carbonique dégagé variant : de 0 ce. 8 à 1 cc. pour un dégagement moyen de 2 ce.7 à 3 cc.5, de 0 cc.6 à 0 c. 8 pour un dégagement moyen de 2 ce. 2 à 2 cc. 7, de 0 cc. 8 pour un dégagement moyen de 7 cc .3 à 8 cc. 1, soit des différences de 10 à 37 0/0 dans les résultats.

De plus le temps matériel nécessaire pour effectuer une mesure exacte d’un volume gazeux, les causes d’erreurs multiples qu’il n’est possible d'éviter qu’au prix de manipulations longues et minutieuses, ne permettent pas de multiplier suffisamment les expériences pour obtenir des moyennes, qui en diminuant les écarts des résultats, permettent d'attendre la limite du phénomène. |

M. le Professeur Ch. Richet s’est servi dans ses expériences, du ferment lactique.

La fermentation lactique a sur la fermentation alcoolique l’avantage de produire un acide stable facile à doser par simple acidimétrie au lieu d’un gaz difficile à recueillir et à mesurer. É

L’exactitude, la facilité et la rapidité du dosage acidimétrique permet de multiplier autant qu’il peut être né-

CAO.

cessaire le nombre des expériences et d'effectuer simultanément 100 à 200 essais.

La fermentation lactique présente comme le ferment alcoolique des différences dans son action. Lorsqu'on s’adresse à un phénomène vital on ne peut jamais être certain d'obtenir toujours des résultats identiques ; tout phénomène biologique est soumis aux différences individuelles que tout être vivant présente. Aussi dans toute recherche biologique, physiologique ou bactériologique devons-nous multiplier autant que possible les expériences, les accumuler en se mettant toujours dans des conditions aussi identiques que possible, ce qui permet d'obtenir une moyenne qui tend à se rapprocher de la valeur limite du phénomène examiné. ;

Les plus grands écarts entre les valeurs maxima et minima d’acidité observés n’ont jamais dépassé 1, 6 à 16 0/0.

Tous ces motifs, m'ont fait préférer la fermentation lactique à la fermentation alcoolique pour étudier la courbe de vitalité. |

Le ferment lactique pur a été obtenu en séparant par culture en série dans du petit lait stérilisé et par isolement sur agar-agar des ferments développés spontanément dans du lait abandonné pendant 12 heures dans une étuve chauffée à 350.

Examiné au microscope ce ferment se présentait sous l’aspect de cellules groupées en chaînettes semblable à celui décrit par M. Duclaux.

Dans toutes nos expériences nous ensemencions nos ballons avec un ferment rajeuni provenant d’une culture faite dans du petit lait, et datant de 24 heures.

Nous avons pu conserver notre ferment lactique pur et toujours doué de propriétés identiques jusqu'à la fin de nos expériences en ayant soin de rajeunir fréquemment nos cultures par des réensemencements fréquents.

Je vais maintenant décrire la préparation du petit laitet les précautions qu’on doit y apporter.

On fait boullir du lait, dont on sépare la caséine en la coagulant par quelques gouttes d'acide acétique, puis on neutralise avec de la potasse.

On ajoute avant la neutralisation quelques gouttes d’une solution alcoolique, de phtaléine du phénol qui indique par son virage au rouge le moment ou la neutralité est atteinte.

Le ferment lactique n’a aucune action sur la phtaléine du phénol qui vire après la fermentation avec autant de sensibilité qu'avant. | 4

La petite proportion de phtaléine de phénol ainsi ajoutée n’a aucune action sur l’activité de la fermentation lactique, des expériences comparatives faites sans phtaléine et avec phtaléine nous ont donné des résultats identiques.

Après neutralisation on chauffe le petit lait à 115° à l’autoclave, il se précipite alors des albumines qu’on sépare; si on n’observe pas ces précautions on aurait au moment de la stérilisation un dépôt de matières albuminoïdes qui pourrait entraîner la substance qu’on veut faire agir ce qui serait une cause d’erreurs dans les expériences.

On filtre et on conserve le petit lait pour l'usage dans des ballons bouchés avec de l’ouate après stérilisation à 118° pendant 15 minutes.

Nous préparons environ 20 litres de petit lait chaque

Cas) PE

fois, on à ainsi l’avantage d’avoir un petit lait homogène pour chaque série d'expériences.

Lorsqu'on stérilise le petit lait il est très important de surveiller l’autoclave et de ne pas dépasser 118° car en milieu neutre le lactose se détruit et se caramélise avec la plus grande facilité à 120°. |

Pour chaque série d’expérience on prélève la quantité de petit lait nécessaire qu’on mélange intimement pour ke rendre homogène.

On mêle d’une part parties égales de petit lait et d’eau distillée, d'autre part on ajoute à une solution titrée de la substance qu’on examine la proportion de petit lait et d’eau distillée nécessaire pour obtenir une liqueur au titre voulu et contenant 50 0/0 de petit lait. É

Le petit lait étendu à 50 0/0 d’eau distillée constitue le milieu normal qui sert de témoin.

Les liqueurs ainsi préparées sont réparties dans des ballons Pasteur par fractions de 50 cc. puis stérilisés comme il a été dit plus haut à 118°.

On ensemence avec une trace de ferment provenant d’une culture datant de 24 heures prélevée avec un fil de platine stérilisé.

On met le tout dans une étuve chauffée à 37°.

Au bout d’un temps déterminé on effectue la neutralisation des liquides avec une solution de baryte titrée.

Dans d’autres séries d'expériences on ajoute à 25 cc. d’une solution litrée stérilisée de la substance à examiner 25 cc. de petit lait qui fermenté depuis 24 heures et qu'on vient de neutraliser exactement avec de la lessive de po-

her

tasse stérilisée. On remet le tout à l’étuve pendant un temps déterminé puis on dose comme ci-dessus.

On prend toutes les précautions usitées en pareil cas pour éviter l'introduction de germes étrangers.

Nous faisons simultanément une autre expérience dans les mêmes conditions mais en ajoutant du petit lait stérilisé neutralisé qui ne contient que 2 à 3 0/0 de petit lait fermenté.

On verra plus loin dans quel but nous avons fait cette dernière série d'expériences.