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Il importe d'opérer toujours avec les mêmes quantités de réactifs. Et, si l’on veut faire des mesures absolues à 2 p. 100 près, il faut que la concentration en ammoniaque soit fixée à

Tagckau VII.

DIVISIONS Sue du colorimètre acétylacétique

dues à l'acétylacétate | POUr une division ® du colorimètre

ACIDE DIVISIONS acétylacétique du colorimètre

D p. 100 près, et celle de SO,(NH,); à 2 p. 100 ; celle du nitroprussiate pourrait par contre varier dans de plus larges limites.

La température à laquelle on opère, tout comme les concentrations en réactifs, a aussi son influence.

Si l’on veut appliquer la méthode, il faudra donc déterminer . au préalable : 1° le temps au bout duquel se produit le maximum de la coloration ; 2° la valeur d’une division du colorimètre.

INFLUENCE DE L’ACÉTONE. — On sait que, comme l’acide acétyÿlacétique, l’acétone donne la même coloration grenat avec le nitroprussiate en milleu ammoniacal, mais beaucoup plus faible. D'autre part, si l’on opère avec les quantités de réactifs utilisés ci-dessus, on voit que le maximum de coloration se produit seulement au bout de vingt et une minutes (fig. 3). Et, à concentration moléculaire égale, l’intensité de ce maximum est vingt-quatre fois plus faible avec l’acétone qu'avec l'acide acétylacétique. Ce rapport sera encore accru si l’on compare les colorations après un temps de neuf à douze minutes.

On voit donc que l’acéltone ne gênera pas si elle est à une concentration moléculaire égale à la moitié de celle de l'acide acétylacétique. Cette condition sera réalisée dans nos expériences. L’aldéhyde éthylique donne aussi une coloration grenat avec le nitroprussiate, mais celle-ci est encore plus faible qu'avec l’acétone, elle ne pourra gêner nos résultats, car dans nos milieux l’aldéhyde se trouve encore dans de plus faibles proportions que l’acétone.

En résumé, le dosage de l’acide acétylacétique par la réaction de Legal sera particulièrement indiqué dans des récherches systématiques pour des mesures en série.

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DosAGE DE L'ACIDE ACÉTIQUE.

C’est un acide volatil, entraînable par la vapeur d’eau, facilement identifiable par les courbes de Duclaux (74). Nous avons vu (p. 22) que c'était le seul acide volatil contenu dans nos émulsions bactériennes.

Nous l’isolerons donc en disüllant le liquide à analyser préalablement acidifié et en l’épuisant ensuite par la vapeur d'eau. Il est à remarquer que de cette façon un peu d'acide lactique sera entraîné. Dans nos expériences, 1l y en avait 4 à 5 p. 100. Pour éliminer cet acide, on pourrait le détruire par l’oxyde rouge de mercure suivant la méthode de Friedemann (75), mais outre que cette destruction est très lente, même à l’ébullition, cela complique le problème. On uülisera de préférence la remarque de Virtanen (76) qui note que si l’on disulle 100 c c. de 200 c.c. d’un mélange d’acide acétique et d’acide lactique, 1l ne passe pratiquement pas de ce dernier acide et la proportion d'acide acétique disullée est constante.

Nous avons vérilié cette méthode et nous opérons donc comme suit : à 30-60 c.c. de liqueur contenant environ 60 mg. d’acide acétique on ajoute 2 à 4c.c. d'acide cixique à 40 p. 100. On distülle jusqu’à obtenir un résidu de 10 c.c. que l’on extrait par la vapeur d’eau jusqu’à ce que le volume du disüllat soit exactement de 200 c.c. (Il est nécessaire d'ajouter à la liqueur à disüller quelques gouttes d'huile de paraffine afin d'éviter les mousses.) Ces 200 c.c. sont versés dans une Erlenmever de 500 c.c., on en distille sans colonne 100 c.c. en vingt-huit minutes environ. On titre par l’eau de chaux l'acidité de ce dernier disullat qui représente 35,3 p. 100 de l'acide acétique contenu dans la liqueur à analyser.

La proportion d’acide lactique passant dans ce dernier distillat de 100 c.c. titrable par l’eau de chaux est moins de 1 p. 100 de l’acide lactique contenu dans les 200 c.c. du premier distüllat.

DOSAGE DES ACIDES LACTIQUE ET f-HYDROXYBUTYRIQUE.

Les meilleures méthodes de dosage des acides lactique et 6-hydroxybutyrique utilisent la propriété qu'ont ces acides de donner respectivement de l’aldéhyde et de l’acétone sous l’action de certains oxydants. Le rendement de ces oxydations dépendra naturellement des conditions expérimentales. Quoi qu'il en soit, le dosage d’un de ces acides se ramènera au dosage d’un mélange

(HMLoc. cit. n°060, (75) FRIEDEMANN, J. biol. Chem., 1938, 123, 161. (76) VIRTANEN, Puzxmr, J. Am. Soc., 1928, 50, 3138.

d’aldéhyde et d’acétone. C’est ce dernier problème que nous allons d’abord étudier.

DosAGE D'UN MÉLANGE D’ALDÉHYDE ET D'ACÉTONE. — L'aldéhyde possède toutes les propriétés de l’acétone, mais a, de plus, des propriétés réductrices qui permettent de le doser spécifiquement ou de l’éliminer.

= Les réactions communes aux aldéhydes et aux cétones servant au dosage sont

1° Formation d’une combinaison bisulfitique par addition de bisulfite. La réaction n'est totale qu'avec l’aldéhyde (77, 78). Avec l’acétone, la quantité formée dépend des conditions opératoires (79). Nos essais nous ont montré qu’on aboutissait à un équilibre

acétone + bisulfite Fra combinaison bisulfitique

obéissant à la loi d'action de masse, de sorte qu’il est pratiquement impossible de doser avec cette méthode l’aldéhyde par différence, surtout si l’acétone est en grande quantités, et que, par conséquent, la méthode de Mondschein (79) est à rejeter. Mais on comprendra aisément pourquoi, si l’acétone n’est pas ‘en fortes proportions, l’aldéhyde entraîné par un courant d’air est seul retenu par une solution de bisulfite (voir p. 40).

2° Formation d’iodoforme par l’iode en- milieu alcalin. C'est le procédé classique de dosage de l’acétone (80). II faut 6 atomes d'iode pour une molécule d’acétone. Avec l’aldéhyde, la quantité diode disparu dépend des concentrations et de la température (81). Ce qui fait aussi rejeter cette méthode pour un dosage de l’aldéhyde par différence.

3° Formation d’une oxime par action de l’hydroxylamine. Cette méthode est assez peu employée. I faut aussi définir les conditions expérimentales (82, 83). ;

4° Formation de dinitrophénylhydrazone par action de la dinitrophénylhydrazine.

Ces composés ont été surtout utilisés pour doser des acides céloniques comme l'acide pyruvique. Ils se prêlent certainement très mal pour séparer l’aldéhyde de l’acétone.

Il résulte donc de ces considérations que nous n’avons qu’une seule méthode de dosage de l’acétone, c’est celle de Messinger.

(77) Rirper, Monath., 1900, 21, 1079.

(78) Cause, J. Biol. Ch., 1922, 52, 263.

(79) MonsceIN, Bioch. Z., 1912, 42, 91.

(80) Loc. eit., n°068:

(81) Furrx et Caarnass, Bioch. Z., 1910, 26, 199.

(82) Lancenux, Ree. Trav. Ch. des Pays-Bas, 1927, 46, 215. (83) Pazrray et Tarrarn, C. R., 1934, 199, 296.

Si nous avons en plus de l’aldéhyde, il faudra l’éliminer en utlisant ses propriétés réductrices.

On a proposé dans ce but l’eau oxygénée et le peroxyde de sodium (84, 85), le réactif de Scott Wilson (86), l’oxyde d’argent ou la liqueur de Fehling (87). Par ces procédés il est nécessaire de porter la liqueur à l’ébulliiôn. Malgré la présence d’un réfrigérant ascendant, une forte proportion d’acétone s’échappe (4 à 10 p. 100). Si on essayait de l’absorder, on reliendrait aussi l’aldéhyde qui se serait vaporisé avant d’être oxydé.

Le réactif de Nessler agit à froid. Son action a été étudiée par Bougault et Gros (88). Fleury et Awad (89, 90) en ont déduit une technique pour le dosage simultané de l’aldéhyde et de l’acétone. Mais cette méthode nécessite l’utilisation de petites quantités de liquide, 25 c.c., alors que nous aurons à doser l’acétone dans un disüllat de 100 c.e. (voir p. 40) et l’utilisation d’une centrifugeuse. Des recherches que nous allons exposer nous ont montré que le réactif de Tollens qui se prête au dosage de l’aldéhyde (87) peut servir à éliminer celle-ci sans altérer l’acétone.

DESTRUCTION DE L’ALDÉHYDE PAR LE RÉACTIF DE TOLLENS. — Nous préparons la solution de nitrate d'argent ammoniacal ou réactif de Tollens suivant cet auteur (91). On dissout 3 gr. de nitrate d’argent dans 30 c. c. d’ammoniaque à 20 p. 100 et 3 gr. de soude fondue dans 30 €. c. d’eau. On mélange ensuite ces deux solutions. Le réactif ainsi obtenu se conserve des semaines à l’obscurité.

À 100 c.c. de solution d’aldéhyde placée dans un ballon de 800 c.c. qui servira à la distillation, on ajoute 4 c.c. de réactif de Tollens et I goutte de sulfate de Mn 4 p. 100. Ce dernier est, nécessaire pour amorcer la réaction lorsque les quantités d’aldéhyde sont faibles (tableau VII).

Au bout de quelques secondes, le précipité d'argent se forme, il peut adhérer aux parois. On laisse le mélange un quart d'heure à la température du laboratoire. On acidule ensuite par de l'acide phosphorique dilué trois fois de manière à amener le pH à une valeur inférieure à 4. On distülle avec le réfrigérant de Schlæssing-Aubin comme dans le cas de l’acélone et on dose dans le distillat l’aldéhyde non détruit par le bisulfite avee une solution d’iode N/200 suivant la méthode de Clausen (92).

(84) Orro Fou, Laboralory Manual Biological chemistry, 1929, 201. (85) Loc. cit, no 38:

(86) Laniscav KziwG, Bull. Soc. Ch. biol., 1932, 414, 885.

(87) Srxre et Frixr, Hopp. Sey., 1921, 416, 298.

(88) Boucauzr et Gros, J. de Pharm. et de Ch., 1922, 26, 5.

(89) Fceury et Awan, J. de Pharm. et de Ch., 1926, 3, 406 et 449. (90) Fceury et Awan, Bull. Soe. Ch. biol., 1926, 8, 550.

(91) Tozcens, Ber. D. Ch: G:, 1882,.45, 1635.

(92) PErniGon, Ann. des Ferm., 1941, 6, 143.

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