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le cycle de l’acide citrique de Krebs et dans les théories de Szent- Gyorgi. Avec le bacille M nous avons trouvé que le rouge congo à la concentration de M/2 107 diminuait notre oxydo-réduction seulement de 12 p. 100 alors qu'è à cette concentration la fumarase n’agit plus.

C’ est une deuxième raison pour éliminer des réactions possibles dans la glycolyse du bacille M, le cycle de l’acide citrique.

Considérations physico-chimiques.

Nous nous proposons d'étudier maintenant l’oxydo-réduction glucose-acide acétylacétique, du point de vue physico-chimique. Nous analyserons ici les mémoires de Wurmser et de Boe (116). Wurmser et Mayer (117), Barron et Hastings (118), Green, Dewan et Leloir (119) et nous verrons les conséquences que nous pourrons en tirer.

Le passage de l’acide acétylacétique à l’acide 8-hydroxybutvrique nécessite théoriquement la présence d'hydrogène sous une certaine tension. Pour faire apparaître celte tension et la rendre mesurable, il faudra premièrement la présence de la diastase spécifique qui permet à l’oxydant ou au réducteur d'agir sur ces composés, mais cette diastase n’agit pas sur l’électrode de platine parce que c’est un colloïde. Il faut alors ajouter au milieu un corps oxydo-réducteur capable d’impressionner l’électrode, c’est-à-dire un corps électro-actif ; celui-ci devra être au voisinage de son virage pour que son potentiel d’électrode soit défini et par conséquent facilement et fidèlement mesurable. Dans le cas de l'acide 6-hydroxybutyrique, on prend le benzylviologène et dans le cas de l’oxydo-réduction acide pyruvique-acide lactique, on prend le mélange de pyocyanine et de violet de crésyl.

Nous aurons alors les équilibres suivants que nous écrirons dans le cas de l’acide acétylacétique

acide ac. ac. + coenzyme réduit : * acide 8-hydroxybutyrique + coenzyme oxydé.

colorant + coenzyme réduit = se * colorant réduit + coenzyme oxydé.

C’est le colorant qui sera capable d'échanger des électrons avec l'électrode car 11 se dissocie

colorant +- 2e is colorant réduit

(116) Wurmser et DE Box, C. R., 1932, 194 2139. (117) WurmMser et Mayer, C. R., 1932, 495. Si.

(118) BarroN et HasrinGs, J. Biol. Chem., 1934, 1407, 567. (HP MPOo CC AnoMlD |

Le potentiel mesuré dépend uniquement du pH et des proporions d'acide acélylacétique et d'acide f-hydroxybutyrique. Les quantités d’enzyme et de colorant n’interviennent pas, 1ls sont tous les deux en équilibre avec leur forme réduite et en quantités trop faibles par rapport aux corps cétoniques pour pouvoir imposer leur potentiel. Celui-ci sera de la forme

ES AO RT, | acide 6-hydroxybutyrique PT acide acétylacétique

La vérification de cette formule, à un pH donné, prouvera la réversibilité de la réaction.

Si l’on tent comple du pH et de la dissociation des acides, nous aurons la relation suivante due à Clark et Borsook

RT L acide B-hydroxybutyrique total "IS RT i 1 2F ” acide acétylacétique total FN [H +] n RTK Kr+ (H+] FILE + [H +]

Ex = be —

dans laquelle

R est la constante des gaz parfaits

T, la température absolue

F, le Faraday

H+ est la concentration des ions H+

Ko; la constante de dissociation de l'acide oxydé,

soit 2,6 10 —4 pour l’acide acétylacétique soit 3,2 10 —3 pour l'acide pyruvique

K;, la constante de dissociation de l'acide réduit

soit 3,9 10 —5 pour l’acide $-hydroxybutyrique et 1,55 10 —4 pour l'acide lactique.

Au voisinage de la neutralité où nous opérons, la valeur du dernier terme est négligeable.

Es caractérise le pouvoir oxydo-réducteur des systèmes étudiés.

A 38°, Eo—<+0,150 volts pour le système $-hydroxybutyrique acide acétyl acétique Eo — + 0,248 volts pour le système acide lactique acide pyruvique.

D’après les travaux cités, nous avons dessiné sur la figure 7 les courbes donnant pour ces deux équilibres Ex en fonction du pourcentage de corps réduit à pH 7 et à 37°. Nous y avons ajouté celles relatives à l’équilibre cozymase-cozymase hydrogénée et celles relatives à l'équilibre acide fumarique-acide succinique d’après les données de Green et Dewan (120) et de Wurmser (121).

(120) Green et DEwan, Bioch. J., 1937, 31, 1069. (21) Wurmser,. Oxydalions et réductions 281.

«ÿ tenir

Nous voyons donc que l'acide G-hydroxybutyrique est un réducteur plus énergique que l’acide lactique. L’acide acétylacétique, qui peut oxyder le glucose, ne pourra pas oxyder l'acide lactique en acide pyruvique et on comprend ainsi pourquoi cet acide s’accu-

en volts

0 50 ECO % de reouction

Fre, 1.

mule dans nos expériences, particulièrement en: l'absence d’oxygène. Nous avons vérifié que l'acide lactique ne disparaît pas lorsque le bacille M n'a comme oxydant que l'acide acétylacétique alors qu’en présence d'oxygène ce bacille transforme l'acide lac-

tree

tique en acide pyruvique décelable par la réaction de Simon. Green a montré que la cozymase était le coferment de la G-hydroxybutyrique oxydase. Nous comprenons done pourquoi celle-ci se trouve en si grandes quantités dans le bacille M (voir p. 15).

Dans l’oxydo-réduction glucose-acide acétylacétique, c’est donc vraisemblablement la cozymase réduite par le glucose qui hydrogène lacide acétylacétique. Mais nous ne pouvons rien dire sur le mécanisme de la réduction de la cozymase.

Néanmoins, ces considérations physico-chimiques nous aident à comprendre le mécanisme de l’accumulation de l’acide lactique et nous montrent l'impossibilité théorique de certaines réactions.

Discussion et conclusions du deuxième chapitre.

Après le travail d'analyse qualitative qui constitue le premier chapitre, 1l nous fallait démontrer par des chiffres l’existence de loxydo-réduction glucose-acide acétylacétique avec production concomitante d’acide lactique. C’est l’objet de ce deuxième chapitre qui nous donne, en plus, d’autres renseignements sur le mécanisme de la glycolyse.

I. La recherche des conditions optima de l’oxydo-réduction fait apparaître la fragilité du système enzymatique du bacille M : il faut prendre une culture d’un âge déterminé et opérer à un pH voisin de la neutralité. La levure est, de loin, beaucoup plus résistante, c’est une raison de plus pour nous faire rejeter la possibilité d’une glycolvse phosphorylante en {ous points identique chez ces deux organismes.

Il est normal de supposer que la cozymase est le coferment de la réductase de l'acide acétylacétique. Le transport d'hydrogène se fait par son intermédiaire, du glucose sur l'acide acétylacétique. Mais si dans la fermentation alcoolique la cozymase est hydrogénée par l’aldéhyde phosphoglycérique, rien ne nous permet d'affirmer qu’il en est de même ici. Lors de la formation d’alcool, celte oxydo-réduction est seule à libérer une acidité qui d’abord fixe se transforme en acidité volatile par la décarboxylation de l'acide pyruvique.

La cozymase oxyde le glucose et c’est un produit d’oxydation de ce dernier qui, après transformation, est réduit par la cozymase hydrogénée, le cycle est fermé sur lui-même tandis qu'avec Île bacille M il faut pour qu'il y ait libération d’acidité, la présence simultanée d’un réducteur, le glucose, et d’un oxydant, lPacide acétylacétique. L'un dé ces corps seuls ne libère pas plus d’acidité que sans substrat.

Or, en admettant qu'il y ait 1 molécule d’acide libérée lorsque la cozymase est réduite pour hydrogéner ensuite l'acide acétylacélique, nous sommes encore loin de l'expérience et il faut

penser soit que la cozymase elle-même préside à d’autres oxydoréductions, soit qu’une diastase différente agit de la même façon.

Il est assez remarquable de constater que l'acidité libérée par unité de temps est la même avec l'oxygène ou l'acide acétylacétique ; il est donc à supposer que c’est la vitesse d’oxydation du glucose qui est la plus lente de toutes et que c’est elle qui détermine la rapidité de la glycolyse, mais dans ce cas on ne comprend pas encore pourquoi il y a moins d’acidité LHbérée par moléeule de glucose disparue en présence d'oxygène qu’en présence d’acétylacétate.

La cozymase oxyde spécifiquement l'acide 8-hydroxybutyrique gauche ; comme Friedmann, avec la levure, obtient de l’acide droit, le mécanisme qu’il a étudié est lié à un autre enzyme.

IT. À côté de la glycolyse, 1l y a l’autolyse qui est un phénomène bien spécial, on ne retrouve dans les premières heures d’incubation que 25 p. 100 de l’acidité libérée sous forme d’acide 6-hydroxybulyrique alors que l’on sait que si celle-ci se poursuit plusieurs jours, cette proportion atteint 70 p. 100. La courbe d’acidité formée sans substrat a d’abord une pente assez forte qui diminue ensuite pour atteindre une valeur constante à parür de la deuxième heure. f

Après une heure ou deux d’autolyse les bacilles ont perdu leurs propriétés oxydo-réductrices. Il y a donc, dans cette période, destruction du système enzymatique et une parte de lacidité libérée doit être due à ce phénomène. On conçoit très bien que dans cette opération, il y ait mise en liberté d’acide phosphorique par la déphosphorylation des coenzymes qui sont ainsi inactivés.

En présence de glucose seul, cette autolyse entraîne une partie du sucre, et une parte de l’acidité libérée se retrouve sous forme d'acide lactique au lieu de se retrouver sous une autre forme. Mais tout ce mécanisme est encore très obscur.

En présence de glucose et d'acide acétylacétique, le système enzymatique fonctionne et ne se désintègre pas de la même manière que sans substrat. Faire un bilan de loxydo-réduction devient done difficile car nous ne connaissons pas en particulier l’acidité due au phénomène d’autolyse, et pour interpréter. les chiffres obtenus et formuler les réactions qui se produisent on pourra se contenter d’une vérification assez grossière, sachant bien. qu'il est impossible d’avoir mieux à cause de la superposition de nombreux autres phénomènes.

Ces restrictions étant faites, nous dirons qu'il disparaît 1 molécule de glucose pour 1 molécule d'acide acétylacétique ou 1 molécule d'oxygène.

La glycolyse du bacille M comprend une partie qui peut se produire avec un oxydant faible comme l'acide acétylacétique et une autre partie pour laquelle il faut un oxydant plus énergique : l'oxygène. Celle deuxième partie comprend l’oxydation de l'acide

pres

lactique qui ne peut se produire avec l’acélylacétate dont le pouvoir oxydant est inférieur à celui de l'acide pyruvique qui doit se lormer.

L’acide acétique qui se produit dans la première partie ne peut l'être à parur de l’acide lactique. Il pourrait néanmoins se former à parur de l’acide pyruvique que le bacille M produit par oxydation du lactale en présence d’air.

L’acide lactique et l’acide acétique sont donc des étapes de la fermentation 6-hydroxybutyrique et le cycle de l'acide citrique est à écarter.

Sur le devenir de l’acide acétique nous ne pourrons faire que des hypothèses. La polymérisation de ce dernier ou la formation d'acide acétopyruvique, comme le suppose Krebs, ne suffit pas à expliquer les phénomènes, puisque l’acide acétylacétique qui en résulterait n'est pas un composé intermédiaire.

L'hexosemonophosphate se polymérise en glycogène et libère de l'acide phosphorique (122), mais on ne peut pas $ynthétiser directement le glycogène à parüir du glucose, c’est théoriquement impossible. Par nalonte. on peut penser qu'il en est de même ici et que l’acide 6-hydroxybutyrique se produit à l’état d’un composé phosphorylé qui par polymérisation donnera le corps Y. L'acide acétylacétique proviendrait de l’hydrolyse anormale de l’ester phosphorique correspondant qui, lui, serait un interméaire normal de la glycolyse.

Et ceci nous ferait comprendre l’acidose chez les diabétiques. Tout comme avec le bacille M, l'acide acétylacétique serait un produit accidentel de l'organisme humain, mais si celui-ci sv une il entre en oxydo-réduction avec le glucose et produit ainsi, à côté de l’oxygène, une acidité qui est surtout fixe et ne peut être éliminée par les organes respiratoires.

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