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de réactions à potentiels d’oxydo-réduction très différents, dont les systèmes catalytiques ne peuvent coexister entre eux et ne sont pas toujours des protéines en milieu aqueux homogène. Certains de ceux-e1 doivent forcément être matérialisés lopographiquement dans la cellule. C’est là toute une chimie à créer, chimie de réactions hautement spécifiques dépendant de l architecture de mieux dans lesquels il sera souvent difficile de voir clair et qui ne pourront êlre analysés par les méthodes utilisées jusqu'ici, méthodes que nous allons maintenant passer en revue. Nous voulons parler des fermentations déviées.

La fermentation alcoolique normale donne, avec un rendement de 98 p. 100, deux molécules d’alcool pour une molécule de Le ceci si on laisse le milieu s’acidifier normalement à pH 45. Au contraire, si l’on tamponne le milieu au pH de 6,8 en Ps de la craie, on change les conditions de fonctionnement des enzymes intracellulaires et on voit apparaître de l’acide pyruvique ainsi que de l’acide lactique. Cette découverte de Fernbach et Schoen (16, 17) a été le point de départ de nombreuses recherches et il est maintenant classique de considérer l’acide pyruvique comme l'intermédiaire indispensable de la formation d'alcool. La maîtrise du pH a permis de mettre en évidence un stade de la fermentation alcoolique.

Pour atteindre des résultats analogues, il est beaucoup d’autres procédés que personne n° ignore. C’est l’emploi des inhibiteurs ou poisons. Le toluène inhibe la déphosphorylation de lhexosediphosphate, le fluorure, la transformation d’acide phosphoglycérique en acide phosphopyruvique, d’où la découverte de ce premier acide. La présence d’acide malonique permet l’accumulation d'acide succinique en inhibant la déshydrogénase de ce dernier. Citons encore l'acide monoiodacétique, des colorants comme le rouge congo ; ils sont pléiade. On a souvent attribué à ces poisons, dans des réactions diastasiques, des spécificités qu’ils n’ont pas toujours. Malgré tout, l’utilisation de ces inhibiteurs a été féconde ; mais il n’existe pas encore de théorie pour expliquer leur action et permettre de synthétiser dans quelques règles la somme de ces connaissances.

D’autres composés n’agissent pas comme poison mais forment des combinaisons avec certains intermédiaires. L’hydrazine capte les cétones, le sulfite empêche l’aldéhyde d’être réduit en alcool par suite de la formation stable d’un composé bisulfitique.

Notons aussi que les éléments marqués, produits nouveaux de la chimie moderne ont donné des résultats intéressants. Le phosphore radio-actif a été employé pour étudier certaines transfor-

(16) FErnBacx et SCHoEN, C. R., 1920, 170, 764. (17) Ferxsicx et SOHoEN, C. R. Soc. Biol., 1923, 89, 475.

EU QUeES mations et la réversibilité de l’hydrogénätion de la cozymase par l’aldéhyde phosphoglycérique.

Ayant ainsi rapidement passé en revue les principales méthodes qui nous permettent de déceler et d'isoler, des intermédiaires de la glycolyse, il nous faut examiner maintenant les divers genres de réactions qui peuvent se produire. Au fur et à mesure que l’on découvrait de nouveaux intermédiaires, on cherchait à isoler l’enzyme qui permettait leur transformalion. C’est le problème de l'isolement des diastases. Il n’y a réellement que peu de temps qu'on les a séparées du complexe zymasique du suc de macération. Meverhof et Warburg ont les premiers montré tout le parti que l’on pouvait tirer d’un tel matériel.

Dans ces complexes il y a premièrement des protéines dont certaines ont pu être obtenues à l’état cristallisé et qui catalysent des réactions d’isomérisation. Ainsi, sous l’influence d’une zymohéxase, l’hexosediphosphate se transforme en deux molécules de triosephosphate ou bien, sous l’influence d’une protéine ferment (C) isolée par Kiessling (18) du suc de macération, nous avons l'équilibre :

acide phosphorique + glycogène C > acide hexose 1 phosphorique.

Cette protéine se décompose même en deux fractions, une phosphorylante, une autre déphosphorylante.

À côté de ces réactions qui sont des isomérisations réversibles, il y a un second type qui nécessite la présence d’un cofermeni transporteur d'hydrogène. Ce sont des oxydo-réductions. Parfois le coferment est séparable par simple dialyse (cozymase), parfois, pour l’isoler, il faut uüliser d’autres procédés (19), c’est le cas du ferment jaune (alloxazine adénine dinucléotide), Comme réaclion Lype nous citerons l’oxydo-réduction de la fermentation alcoolique.

La cozymase, en présence d’une protéine isolée à l’état cristallisé (Warburg et Christian) est hydrogénée par l'acide 13 elycéroaldéhydediphosphorique. Il a fallu isoler ce système à l’état de pureté pour que Negelein et Brôümel (20) puissent mettre en évidence Ta formation intermédiaire de l’aldéhyde diphosphoglvcérique et de l'acide diphosphoglycérique qui phosphoryle ensuite l'acide adénylique. La phosphorylation par l'acide phosphorique de laldéhyde phosphoglycérique diminue l'énergie libre qui apparaît dans la réduction de ce dernier composé, mais. par contre, celle réduction a pour effet d'augmenter l'énergie de la liaison avec Facide phosphorique qui pourra alors passer sur

(18) Kiss, Bioch. 7 1939, 302, 50.

(19) WargurG et CHrRisrIAN, Bioch. Z. 1938. 298 150. (20) NecëzEIN et Bromerz, Bioch. Z., 1939, 304, 135

l'acide adénylique : il y a eu transport d'énergie à l’intérieur même de la molécule. À proprement parler, il n'y a pas de couplage, mais tout se passe comme s'il y en avait un. Et la cozymase est ainsi réduite avec un minimum de perte d'énergie chimique. Ce qui se conçoit d'ailleurs, car s’il en était autremert? l’enzyme s’échaulfferait trop et risquerait d’être décomposée.

Evidemment on a aussi montré [Negelein et Wulff (21)] qu'il existait une protéine cristallisée permettant la réduction de l’acétaldéhyde par la cozymase hydrogénée.

Ces résultats nous montrent le rôle capital de l’acide phosphorique déjà mis en évidence par Parnas (22) et nous font entrevoir avec l’acide diphosphoglycérique un composé phosphorylé d’une labilité encore inconnue (ce serait un anhydride mixte de l’acide phosphoglycérique et de l’acide phosphorique). Ils. justifieront, pour une large part, les hypothèses que nous émettrons à la fin de cet exposé. Mais nous serions incomplets si nous ne donnions pas un aperçu des divers cycles de transformalion que nous connalssons.

Le schéma de la fermentation alcoolique, les mutations du glucose en hexosediphosphate, acide phosphoglycérique, acide pyruvique, aldéhyde, alcool sont trop connus pour que nous les reproduisions ici. Et le bacille M ne vit qu’en présence d'oxygène.

La dégradation aérobie du glucose n’a pas élé aussi approfondie et nous ne possédons là-dessus que des connaissances fragmentaires. Evidemment la transformation d'acide pyruvique en acide acétique est aujourd'hui démontrée ; mais il n'existe pas de théorie rendant compte de la combustion totale du glucose ; quant à la resynthèse des glucides à partir de lacide lactique, si elle est connue depuis les travaux de Meyerhof, nous n’en avons pas encore saisi le mécanisme profond.

On n’a pas pu, dans cette dégradation, isoler stade par stade chacune des réactions. Malgré cela, les théories se sont donné libre cours. Szent Gyorgyi (23) cantonne la glycolyse à un transport d'hydrogène sur les accepleurs actuellement connus, acide fumarique, acide ascorbique, caléchol, cytochrome et enfin l'oxygène.

Serrant de plus près les faits, les recherches de Knoop et Martius. comme celles de Krebs, rendent vraisemblable l’union de l’acide pyruvique et de l'acide oxalacélique pour donner, après oxydation, de l’acide citrique ; lequel, par suite d’isomérisation, de réduction et de décarboxylation, redonnerait de l’acide oxalacétique qui retournerait dans le cycle figuré ci-dessous ou cycle d'acide citrique de Krebs :

(21) Nececen et Wuzrr, Bioch. Z., 1937, 289, 436 et 293, 351. (22) Parnas, Bull. Soc."Ch. biol., 1935147, 698 ; 1936, 18; 53. (23) Szenr-Gvorevti, Bull. Soc. Ch. biol., 1938, 20, 846.

Die

Triose \ A4 pyruvate | YY : oxalacetate citrate ù malate cis aconitate À | fumarate iso citrate | Y succinate ceto glutarate û |

Les transports d'hydrogène se font par le système fumarate oxalacétate de Szent-Gvyorgyi, Krebs (24).

Ce schéma rend compte de l’oxydation totale d’une molécule de triose. Mais le métabolisme du pyruvate peut aussi se faire par l'intermédiaire de l’acide acétopyruvique (voir p. 3).

Bref, nous voyons qu'il existe certainement plusieurs modes de dégradation aérobie du glucose et que nos connaissances en celte matière sont assez restreintes.

Du point de vue énergétique, il a été entrevu que la respiralion était couplée à une phosphorylation, Kalckar (25), ce qui à été confirmé par nos expériences (26). Mais les extraits tissulaires qui peuvent avoir une glycolvse aérobie sont-ils indiqués pour ces recherches ?

Dans la discussion que nous mènerons plus loin, nous verrons le parti qu'on peut ürer de toutes ces considérations.

Recherche de la phosphorylation.

La tendance actuelle (27) consiste à admettre que toute glycolyse est phosphorylante et qu'une oxydo-réduction aurait lieu entre la cozymase et l’aldéhyde phosphoglycérique. On a pu démontrer que cela pouvait se passer ainsi dans la levure, dans les Uissus animaux (muscle, cerveau, tumeurs, embryon). On utilisait à cet effet soit des cellules intactes, soit plus fréquemment dés extraits. Jusqu'à présent, seule la levure de bière séchée est capable de donner un sue de macéralion transformant comme la cellule vivante le glucose en alcool. , À

Le toluène et le fluorure inhibent la déphosphorylation et la

(24) Kress, Bioch. J., 1940, 34, 775.

(25) Karcrkar, Enzymologia, 1939, 5, 365 et Nature, 1938, 142, S71. (26) MEyernor, Bull. Soc. Chim. biol., 1939, 24, 1100.

27) MEYERHOF et PErRDiGoN, C. R: Soc. Biol., 1939, 132, 186.

lite

transformation de l'acide phosphoglycérique en ‘acide phosphopyruvique. Aussi (28), en empoisonnant la levure de bière par le toluène et le fluorure en présence de phosphate minéral, il y a accumulation de grandes quantités d’acide phosphoglycérique que l’on isole facilement. C’est en opérant de même avec des bactéries (citrobacter Freundii, Propioni Bacterium, aerobacter indologenes, B. subtilis, etc.) que Werkmann et ses collaborateurs mettent en évidence la formation de cet acide. Celui-ci ne peut, par contre, être décelé avec Clostridium butylicum, CL. histolyticum, Cl. sporogenes. Toutefois, même dans les cas les plus favorables, l'acide phosphoglycérique est oblenu en quantités moins grandes qu'avec la levure.

Nous nous sommes donc proposé de voir d’abord si le bacille M possédait, ui aussi, une. glycolyse phosphorylante, en essayant simultanément une souche de B. subtilis.

A. PreuiErs Essais, — Nous avons suivi exactement la tech-

nique indiquée par Stone et Werkmann (29). Mais nous avons utilisé pour doser le phosphore, des techniques plus précises : 7 g. de bacilles fraîchement récoltés sont émulsionnés avec 7 c.c. de tampon de phosphate 0,67 M (pH 6,85), 6 c.c. de glucose 20 p.100, 0,1 c.c. MgCl, 1 p. 100 (volume final 35 c.c.), on ajoute 1 c.c. de toluène. Incubation quatre heures à 37° sous atmosphère d’azote. Après élimination des bacilles par centrifugalion :

1° Nous avons mesuré la disparition de phosphore minéral. A cet effet nous utilisons la technique de de Lohmann et Jendrassik (30) avec le photocolorimètre de Meunier (31). Les résultats sont consignés dans le tableau E.