EMPLOI DE LA GÉLATINE COMME MILIEU DE CULTURE

Pour déceler la présence des germes et pour en apprécier la quantité, la méthode la plus simple et la plus rapide est la méthode de Koch, qui repose sur les deux principes suivants :

1° Si l’on ensemence une solution de gélatine amenée à un état de concentration tel que par le refroidissement elle se prenne en gelée, on voit se former des petits points blancs qui s’accroissent peu à peu et forment une sorte de sphère à laquelle on donne le nom de colonie; cette sphère est en effet constituée par un groupement de bactéries développées dans ce milieu très favorable à leur multiplication. Chacune de ces colonies est formée par l’uu des germes qui existaient dans l’eau ajoutée à la gélatine. On peut, à l’aide d’une loupe, compter les colonies et par conséquent déterminer la pureté d’une eau.

2° Ces bactéries ont de plus la propriété remarquable de liquéfier la gélatine; d’autant plus rapidement que leur nombre est plus considérable.

L’examen microscopique des eaux repose sur le double principe que nous venons d’exposer. La manière d’opérer est du reste très simple.

EAUX

Préparation de la gélatine de culture. — Dans 100 grammes d’eau ordinaire, à la température de 45 à 50°, on dissout 5 grammes de gélatine blanche et 2 centigrammes de phosphate de soude. Lorsque la dissolution est opérée, on verse dans le liquide un quart de blanc d’œuf étendu de trois fois son volume d’eau, on agite fortement et on chauffe pendant deux heures au bain-marie ; l’albumine, en se coagulant, entraîne toutes les impuretés, qu’on sépare par une filtration sur un tampon de coton, l’appareil étant placé dans une étuve chauffée à 60 ou 80°. La gélatine pai> faitement transparente est prête pour les observations, on en mesure exactement 10 centimètres cubes et on l’introduit dans les tubes de culture.

Préparation des tubes. — Ce sont de simples tubes à essais munis d'un bouchon de liège percé d’un trou dans lequel s’engage un tube de verre de 3 centimètres de long contenant du coton. On peut encore employer des tubes (fig. 41) coiffés d’un bouchon de verre avec un tube rétréci garni de coton.

Dans chacun des tubes on introduit 10 centimètres cubes de solution encore chaude de gélatine, on rebouche et on place les tubes maintenus verticalement à l’aide d’un support dans un bain-marie muni d’un couvercle et contenant 10 centimètres de hauteur d’eau environ; on porte à l’ébullition et on laisse les tubes pendant 25 à 30 minutes à cette température de 100°, de façon à les stériliser. Les tubes ainsi préparés peuvent souvent se conserver sans altération pendant deux ou trois mois. Si l’on voulait avoir une stérilisation parfaite, il faudrait porter ces tubes dans l’étuve à stérilisation de M. Pasteur, qui est chauffée à 120°; mais dans ce cas la gélatine perd la propriété de s’épaissir par refroidissement. En lui substituant la gélose, sorte de gélatine végétale, cet inconvénient ne se produit pas.

Ensemencement. — Lorsqu’on veut ensemencer ces tubes, la première opération consiste à liquéfier la gélatine, en chauffant au bainmarie sans dépasser 50°, puis, à l’aide d’une pipette de 1 centimètre cube divisée en dixièmes et préalablement flambée, on y verse de centimètre cube de l’eau à examiner. Cette opération doit être faite rapidement et en soulevant le bouchon le moins possible, pour ne pas introduire de poussières de l’air; on agite pour opérer le mélange intime d’eau et de gélatine, mais avec ménagement, de façon à ne pas former de bulles d’air. Il est indispensable d’obtenir un mélange homogène de la gélatine liquéfiée et de l’eau ajoutée.

Numération des bactéries. — Avec la même pipette de 1 centimètre cube, soigneusement flambée, on prend dans le tube de centimètre cube du mélange ensemencé que l’on fait couler avec précaution sur une lamelle de verre flambée et quadrillée en carrés de 2 millimètres de côté, de façon que la gélatine en s'étendant recouvre une surface de 2 centimètres de long sur 1 de large.

Toutes les lamelles correspondant aux différents tubes à examiner sont introduites sous une cloche dont l’atmosphère est humide, à une température de 20°.

Fig. 41.

Cette cloche sera restée en repos sur la plaque quelle recouvre et qui est humectée d’eau, au moins pendant deux ou trois jours, avant le moment où l’on y introduit : es lamelles; dans ces conditions, les germes contenus dans l’air de la cloche se déposent sur les surfaces humides et l'air se trouve ainsi purifié de germes. Pour introduire les lamelles, on soulève légèrement la cloche en l’un des points de sa circonférence et aussi rapidement que possible, on introduit la lamelle et on laisse la cloche revenir à sa position primitive. On évite ainsi, dans la mesure du possible, l’intervention des poussières de l’air.

Dans ces conditions les colonies se développent rapidement et au bout de soixante heures on voit apparaître même à l’œil nu des petits points blancs. Si on porte la lamelle sous une forte loupe grossissant à 50 diamètres, on arrive à compter le nombre de colonies ; le quadrillage est précisément destiné à faciliter cette opération et à éviter les erreurs.

Le chiffre obtenu, multiplié par 1000, donne le nombre de eolonies correspondant à 1 centimètre cube d’eau, et chaque colonie peut être considérée cemmele résultat de l’un des organismes qui se trouvaient originairement dans l’eau examinée. On peut ainsi par ce procédé classer les eaux sous le rapport de leur pureté relative.

Liquéfaction de la gélatine. — Les tubes où l’on a fait les cultures sont mis à une température de 20°; toutes les vingt-quatre heures on les examine, et on note le moment] où en les inclinant légèrement on voit la gélatine couler sur les parois. Cette apparition de la liquéfaction donne des indications utiles. Ainsi, d’après le docteur Proust, on remarque que

Dans une eau très pure la liquéfaction se déclare le 10e ou le 12e jour » pure » 8e

» mauvaise » 4e

» infecte » 2e ou 3e.

Quelque défectueux que soit ce procédé, il peut servir de mesure approximative à la quantité des organismes inférieurs contenus dans une eau ; èt c’est ordinairement dans celles qui sont le plus riches en matières organiques que ces organismes sont le plus abondants. Mais cette méthode ne donne aucune notion sur la nature des infiniment petits qui existent dans les eaux. Cette détermination qualitative a souvent une grande importance, elle nécessite l’emploi de procédés tout à fait différents de ceux que nous venons de décrire.