C. Méthode spcctrophotométrique

Le dosage de l’oxyhémoglobine par cotte méthode exige la fixation préalable du rapport d’absorption A do la matière colorante pour une région spectrale donnée (2). La détermination de cette constante a été entreprise pour la première fois par Hüfner pour l’oxyhémoglobine du sang de chien. Cette operation est fort délicate à cause de la difficulté que l’on éprouve de fixer d’une manière exacte le titre d’une solution d’oxyhémoglobine. Voici le moyen employé par Hüfner et v. Noorden (3j. On prépare une solution concentrée d’oxyhémoglobine cristallisée, bien pure, dont on détermine le titre par évaporation. Cette opération a lieu dans un vase de forme spéciale qui permet d’achever la dessiccation du résidu à 112» dans un courant d’hydrogène. La solution titrée ainsi obtenue

(1) L’auteur ne dit pas comment cette graduation a été obtenue, ni comment on peut la contrôler.

(2) Voyez p. 22 l'exposé général de cette méthode.

(3) V. Noorden, Zeitsch. f. phys. Chem., t. IV, p. 1.

ANALYSE DU SANG. — DOSAGE DE L’HÉMOGLOBINE

est trop concentrée pour pouvoir servir directement à l’analyse. Elle est répartie par portions de 1 à 2 centimètres cubes dans de petits ballonnets tarés et bouchés. On pèse une seconde fois, puis on ajoute de 2o à 35 centimètres cubes d’eau et on reporte sur la balance. On détermine en outre par la méthode du flacon la densité de chacune de ces solutions. A l’aide de ces données, on calcule la concentration de ces solutions, et on mesure au spectrophotomètre le coefficient d'extinction pour la région spectrale choisie. Le rapport d'absorption A est donné chaque fois par la formule

Si l’on fait plusieurs séries de déterminations de ce genre, chaque série portant sur une nouvelle préparation de matière colorante, on arrive à une valeur moyenne de A, qui est entachée d’une erreur très faible. La région spectrale choisie de préférence est celle qui correspond à la deuxième bande. Elle va de D63E à D84E (1). Ilüfner a déterminé en même temps le rapport d'absorption de l’oxyhémoglobine pour la région D32E—D53E, intermédiaire aux deux bandes; on verra tout à l’heure dans quel but. Nous donnons ici, sous forme de tableau, la valeur de ces constantes pour l'oxyhémoglobine cristallisée, bien pure, provenant de différentes espèces animales, Aj désignant les rapports d'absorption pour la région D32E —D53E, AJ ceux qui correspondent à la région D63E —D84E. Dans une troisième colonne figurent les valeurs du quotient calculées à l’aide des chiffres des deux premières colonnes. Enfin une quatrième colonne indique les valeurs de ce même quotient déterminé directement sur les solutions sanguines. Ces résultats ont été obtenus avec l’appareil de Ilüfner (2).

On a suffisamment insisté au cours de l'exposé général de la méthode spectrophotométrique sur la signification si intéressante de ce quotient p- La coïn¬

cidence presque absolue que présentent les valeurs de ce quotient dans les deux dernières colonnes, montre que le sang étendu d'eau ne diffère pas optiquement des solutions d’oxyhémoglobinc cristallisée et qu’on peut appliquer sans crainte les valeurs de ces constantes au dosage de l'oxyhéinoglobine dans le sang en nature (3).

(1) Voyez p. 13.

(2) Ces résultats varient un peu avec l’appareil employé. (Voyez p. 11.)

(3) Voyez p. 28. — La grande similitude des valeurs de A pour les divers espèces animales permet de eonclure que les diverses oxyhémoglobines contiennent au moins un même noyau

Le sang possédant une puissance colorante considérable, il est nécessaire de le diluer fortement (au 1/130 ou au 1/200) pour rendre possible l’analyse spectrale. Ces dilutions peuvent être, faites en mesurant les liquides à l'aide de pipettes graduées; mais pour dos recherches très précises, il vaut mieux opérer par pesées. Si la solution ainsi obtenue absorbe une quantité de lumière trop faible, il est bon de l’examiner sous une épaisseur de 2 ou 3 centimètres. Des mesures photométriTjues, faites sous deux ou trois épaisseurs différentes, constituent du reste un excellent contrôle de l’exactitude des déterminations. Pour que la solution obtenue soit absolument limpide, il est de règle de l’additionner d’une faible quantité de soude, ou mieux de carbonate do soude sec. Koerniloff et Leiclitenstern ont montré que cette addition a pour effet de diminuer légèrement le coefficient d’extinction, c’est-à-dire la quantité de lumière absorbée. La différence, qui est surtout sensible pour des sangs de leucémiques, tient à ce fait que la soude augmente la limpidité du liquide en dissolvant les corpuscules graisseux en suspension. Enfin le dosage de la matière colorante doit se faire à l’état d’oxyhémoglobine; mais il est inutile d'agiter la solution à l’air. L’eau qui a servi à la dilution contient une quantité d’oxygène amplement suffisante pour oxyder toute l’hémoglobine.

Soit =0,63738 le coefficient d’extinction d’un sang de chien dilué au d/200 pour la région spectrale DG3E —D84E; le rapport d’absorption pour cotte région étant, pour le sang de chien, égal à 0,001, il vient

Le liquide observé au spectroscope contenait donc par centimètre cube 08'',00063738 d’oxyhémoglobine, ce qui fait pour dOO grammes du sang primitif 13s'',03. Il est bon de prendre pour la détermination du coefficient d’extinction la moyenne de plusieurs lectures. .Avec le spectrophotomètre deVierordt, l’erreur moyenne de chaque résultat est d’environ 2 grammes pour 100 grammes de matière colorante, avec celui de llüfner d’environ 16'',20 pour 100 grammes. M. Branly arrive avec son appareil à une approximation « qui est, dit-il, supérieure à l/oO (1).»

Comme la quantité do sang nécessaire à un dosage est très minime (de 0",03 à 0",03), le procédé est applicable aux recherches cliniques, comme le démontrent les nombreuses analyses do 'Wiskemann (2), de Leiclitenstern (3), de Branly et Quinquaud (4), de J. Otto (b).

Le dosage simultané de l’hémoglobine et de l’oxyhémoglobine peut être effectué par cette méthode, à la condition que l’on ait déterminé d’avance dans deux régions spectrales les rapports d’absorption dos deux matières colorantes. Il suffit alors de prendre les coefficients d’extinction du liquide sanguin dans

(1) Voyez p. 39.

(2) Wiskemann, ZeiUeh. f. Biol., t. XII, 1876.

(3) Leiclitenstern, Ueber den Ilamoglobulingehalt des Blutes, etc., Leipzig, 1878. — Voyez aussi : Kœrniloff, Zeitsch. f. Biol., t. XII, 1876.

(4) Quinquaud et Branly, Arch. genér. de méd., [vn], X, p, 129.

(.b) J. Otto, Arch. de Pflüger, t. XXXVI, 1883, p. 12.

ANALYSE Dü SANG. — DOSAGE DE L’HÉMOGLOBINE.

les deux régions et d'appliquer la formule qui a été établie page 26. Voici comment opère Hüfner :

Le sang est aspiré directement de la veine dans une seringue, puis introduit dans un tube rempli de mercure et défibriné à l’abri de l’air par l’agitation. Un volume connu de ce liquide doit être dilué ensuite avec de l’eau exempte d'oxygène, afin de pouvoir servir à l’examen photométrique, puis porté au spectroscope à l’abri du contact de l’air. Il serait trop long de décrire ici tous les détails d’une semblable operation (1). Contentons-nous de dire qu’on se sert d’un appareil à boule de forme spéciale (fig. 20). L’espace n est rempli d’eau purgée d’air; le volume m compris entre les deux robinets reçoit, au contraire, le sang défibriné. Toutes ces manœuvres se font à l’abri de l’air. En ouvrant le robinet b, on opère le mélange des deux liquides (2), puis on vide l’espace m et on le balaye d’un courant d’hydrogène qui entre en f et sort en P; un deuxième courant pénètre en S et sort en g. En outre l’hydrogène, au sortir de p, passe dans une cuve de Schultz, de forme spéciale, qui peut être hermétiquement close et dont on chasse ainsi tout l’air atmosphérique. Lorsqu’on juge que toutes les voies sont privées d’oxygène, on donne aux robinets une position convenable et on fait passer le liquide dans la cuve qui est ensuite portée au spectroscope.

Il ne re.ste plus alors qu’à déterminer les coefficients d’extinction dans deux régions spectrales. y

Les volumes m et n ont été exactement jaugés à l’aide du Fig. 20.

mercure, ce qui fait qu’on connaît le degré de dilution qu’a subi le sang. Désignons par :

Ad et A'j les rapports d’absorption de l’oxyhémoglobine dans les deux régions spectrales.

Ar et AV ceux de l’hémoglobine dans les mômes régions.

E et E', les coefficients d’extinction du liquide sanguin.

V, le volume m q- n.

Les poids d’hémoglobine K et d’oxyhémoglobine /i, pour 100 centimètres cubes de sang seront donnés par les formules suivantes :

rxdOO Ar.WIE'A', —EAd) m ■ A'dA.—AjAV ’

, oxlOO AdAilEA,.—E'.AV)

A', A,—Ad AV ■

Ce double dosage peut être contrôlé facilement en agitant à l’air le liquide sanguin, de façon à oxyder toute la matière colorante, et déterminant au spec-

( 1 ) Hüfner, Zeitsek. f. physiol. Chem., t. III, p. 1. — J. Otto, Arch. de Pflûger, t. XXXVI, 1885, p. 12.

(2) On pouvait craindre que, par suite de cette dilution du sang dans une grande masse d’eau privée d’oxygène, une partie de l’oxyhémoglobine ne subît une dissociation en oxygène et en hémoglobine. Hüfner s’est assuré par des essais directs qu’il n’en est rien. {Zeitsch. f. physiol. Chem., t. X, p. 218.)

trophotomètre la richesse Hj en oxyliémoglobine. On devra trouver évidemment :

II„ = Iio + hr-

Les valeurs de .4,, .AV préalablement déterminées par Hüfner sont :

Ar= 0,001091 AV=0,001331.

Le volume m qui est de 1 à 2 centimètres cubes doit être de 130 à 200 fois plus petit que le volume n. Hüfner trouvait ainsi dans une série d’expériences ;

Ho

L’accord est i-einarquable. L’exactitude de cette double détermination a été vérifiée par Lambling. On peut donc à l’aide du spectrophotomôtre, par un procédé à coup sûr délicat mais fidèle, suivre dans leur transformation réciproque les deux matières colorantes du sang et se faire ainsi une idée de l’intensité relative des phénomènes d’oxydation dans les divers territoires sanguins.

Hüfner et ses élèves ont également appliqué cette méthode à des études qualitatives et quantitatives sur la méthémoglobine, l’hémoglobine oxycarbonique, etc... (1).