DU TRANSPORT DES ÉCHANTILLONS

Nous avons insisté, dès le début, sur le faible intérêt que présente la simple numération des colonies, et la grande importance qui existe, au contraire, dans la spécification de ces colonies

Pour faciliter la recherche des germes pathogènes, surtout si on est obligé d’avoir recours à la méthode de cultures sur plaques, il est nécessaire d’opérer sur des échantillons qui n’ont pas trop attendu et qui représentent le plus possible le liquide originel.

En effet, il résulte d’expériences très bien faites que les micro-organismes se développent très rapidement dans des échantillons qui n’ont pas été soumis immédiatement à l’analyse.

Un échantillon d’eau de la Vanne donne (M. Miquel) :

Bactéries

Température, par cent. cube.

Immédiatement . la", 9 -48

2 heures après . 20", 6 125

1 jour après . 21", 0 38.000

2 jours après . 20", 5 125.000

2 jours après . 22", 3 590.000

Plusieurs causes entrent enjeu pour favoriser le développement des bactéries: la température et le manque d’agitation du liquide (qui se traduit par une moindre action de l’oxygène de l’air).

Il est bien certain qu’ après quelques jours, le nombre des micro-organismes

diminue et que les chiffres tendent à redevenir ce qu’ils étaient au moment du

prélèvement.

Ces grandes variations pouvaient avoir des conséquences assez imprévues autrefois, lorsqu’on se bornait à indiquer seulement le nombre de colonies contenues dans une eau. Le seul inconvénient que présente réellement l’analyse tardive des échantillons soumis à l’examen bactériologique, c’est la difficulté de retrouver, dans un très grand nombre de colonies, celles qui appartiennent à des germes pathogènes.

Ces germes sont en quantités très faibles, même dans les eaux les plus contaminées; on augmente donc les chances de les laisser passer inaperçus, et cette seule raison nous engage à préconiser l’ensemencement immédiat sur les lieux mêmes du prélèvement, lorsque la chose est possible, ou l’emploi de glacières pour le transport des échangions.

Ce dernier moyen étant de beaucoup le plus fréquemment employé, c’est celui que nous décrirons de préférence.

L’échantillon d'eau ayant été prélevé avec toutes les précautions voulues, est entouré d’ouate, puis introduit dans une éprouvette à pied à large ouverture, ouverture que l’on ferme avec un bouchon plat en liège. Cette éprouvette est placée ensuite dans une boite rectangulaire en chêne, dont la paroi, doublée intérieurement de feutre, est recouverte de zinc. On remplit la boîte de sciure de bois mélangée de glace (environ 2ke de glace). Le couvercle de la boîte, doublé à l’intérieur d’une lame de caoutchouc de 5"" d’épaisseur, ferme hermétiquement

La température des échantillons contenus dans une semblable boîte est toujours inférieure à 4°.

ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE

Il est assez important de connaître la richesse bactérienne de l'eau soumise à l’analyse. A cet effet, on prend, à l’aide d’une pipette flambée, un centimètre cube de l’eau à examiner, qu’on dilue dans un ballon contenant 100" d’eau distillée et stérilisée. On agite légèrement, de façon à ce que le mélange soit bien homogène, puis on prélève 1“ de ce mélange, qu’on dilue de nouveau dans un autre ballon contenant 100“ d’eau distillée et stérilisée.

On a donc, d’une part, une solution au centième et, d’autre part, une solution au dix-millième.

Ces solutions servent alors à ensemencer des tubes de gélatine que l’on coule sur des plaques ou dans des boîtes de Pétri.

Après 48 heures de séjour à l’étuve, à 20», on peut se faire une idée, à la simple inspection des plaques, du degré de dilution que doit subir l’eau pour que l’étude des colonies soit plus commode.

Cet examen préalable a, en outre, l’avantage de renseigner le bactériologiste

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sur la nature des bactéries prédominantes dans le liquide à analyser, et tout particulièrement sur les bactéries liquéfiant la gélatine.

Un des nombreux reproches que l’on peut faire à cette analyse quantitative bactériologique, c’est le peu d’exactitude des résultats qu’elle fournit, quant à la numération elle-même.

Il faut considérer, en effet, que l’on prend une ou deux gouttes du liquide à examiner, et qu’on les dilue au 1/100% au 1/1000' et même au 1/1. 000. 000% puis, qu’on fait la numération plus ou moins exactement, et qu’on rapporte le résultat final au centimètre cube. On conçoit qu’il puisse y avoir ainsi de très grands écarts.

Ce procédé n’est donc applicable que lorsqu’on analyse des eaux contenant de très grandes quantités de micro-organismes; mais si on examine des eaux pures, certaines eaux de sources, par exemple, il est préférable d’employer le moyen suivant, qui est plus exact.

Ce moyen consiste à déterminer d’une façon précise le volume de gouttes employées, et de les ensemencer directement dans la gélatine.

On prépare, à cet effet, un certain nombre de tubes terminés à l’une des extrémités par une pointe effilée et presque capillaire, l'autre extrémité étant obturée par un morceau d’ouate.

Pour graduer l'instrument, on aspire une certaine quantité d’eau distillée et on laisse couler goutte à goutte, en ayant soin de compter le nombre de gouttes qui est nécessaire pour occuper un volume de 1".

Le nombre de gouttes peut être quelconque, et il suffit de l’inscrire sur la pipette ainsi construite. On a, de la sorte, des instruments qui fournissent 25, 50, 60, 80, 95 gouttes au centimètre cube. Ces pipettes sont facilement stérilisables ; il suffit de les placer, avant de s’en servir, dans un ballon contenant de l’eau en ébullition.

La gélatine ainsi ensemencée est coulée soit dans des boîtes de Pétri, soit dans des flacons coniques employés par M. Miquel.

Ces derniers récipients sont certainement préférables; on peut y prélever, avec un fil de platine, sans trop craindre les poussières de l’air, les colonies qui se trouvent même à la périphérie, et cela autant de fois qu’il est nécessaire.

Un petit inconvénient réside dans la difficulté d’examiner au microscope les caractères physiques de ces colonies.

Milieux de culture. — Les colonies isolées peuvent être étudiées directement au microscope, ou bien servir à l’étude plus approfondie de l’espèce; on les place alors dans des milieux plus favorables à leur développement. Ces milieux de culture sont très variables et n’offrent pas toujours un critérium certain de l’espèce qu’on a réussi à cultiver.

On pensait, il y a quelque temps encore, que l’aspect de la colonie en culture sur des milieux solides, tels que la gélatine, par exemple, pouvait être caractéristique pour certaines bactéries; on a reconnu depuis qu’il y avait quelque exagération à vouloir différencier deux bactéries par le seul fait qu’elles liquéfiaient ou non la gélatine.

Les milieux nutritifs employés pour la culture des micro-organismes peuvent être divisés en deux groupes : les milieux liquides et les milieux solides.

Milieux liquides. — Pasteur, le premier, a démontré que les bactéries pouvaient se développer dans des liquides artificiels, de composition chimique connue.

La solution Pasteur était composée de :

Eau distillée . 100”', O

Sucre candi . 10 ,0

Cendres de levure de bière . 0 ,075

Cette solution avait l’inconvénient, à cause du sucre candi qu’elle renfermait, d’être trop favorable au développement des moisissures. Cohn l’a modifiée ainsi :

Eau distillée . 200»', O

Tartrate d’ammoniaque . 2 ,0

Phosphate de potasse . 2 ,0

Sulfate de magnésie . 1 ,0

Phosphate tribasique de chaux . 0°',1

Ces solutions sont surtout avantageuses pour le rapide développement des levures et des muscédinées. Elles sont, en général, peu favorables aux bactéries, lesquelles y prospèrent moins bien que dans des solutions contenant des matières albuminoïdes en suspension.

Voici une solution employée par Pasteur, qui permet de cultiver certaines bactéries :

Eau . 100 parties.

Sucre candi . 10 —

Carbonate d’ammoniaque . 1 —

Cendres de levure de bière, . 1 —

Enfin, lorsqu’il s’agit d’obtenir d’abondantes cultures de muscédinées, et en particulier de 1 ’Aspergilus niger, on ne saurait mieux faire que de les cultiver dans le liquide de Raulin, dont voici la formule :

Eau . 1.500»', 0

Sucre candi . 70 ,0

Acide tartrique . -i ,0

Nitrate d’ammoniaque . 4 ,0

Phosphate d’ammoniaque . 0 ,60

Carbonate de potasse . 0 ,60

Carbonate de magnésie . 0 ,40

Sulfate d’ammoniaque . O ,25

Sulfate de zinc . 0 ,07

Sulfate de fer . 0 ,07

Silicate de potasse . 0 ,07

Les infusions végétales peuvent, dans certains cas assez restreints, avoir quelques avantages qui ne doivent pas être dédaignés. Leur préparation est des plus simples et consiste, la plupart du temps, en infusion ou en décoction de plantes. Les sucs de fruits, le jus des poires, pommes, etc,, ainsi que les sucs de navets, carottes, etc., sont préparés en coupant les fruits ou les plantes, et en les soumettant à la presse, enveloppés dans un sachet de toile.

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Les jus ainsi obtenus sont filtrés grossièrement, puis stérilisés par le passage à travers des bougies Chamberland (fig. 14).

On peut aussi se servir d’eau de levure ou de décoction de touraillons, cesderniers dans la proportion d’environ 10 p. 100.

Fig. 14.

Quelques micro-organismes se développent très abondamment dans certaines humeurs de l’économie animale. On a souvent employé le sérum du sang des divers animaux, le liquide séreux épanché dans les hydrocèles, dans l’ascite, l’humeur aqueuse de l’œil, le liquide amniotique; on a utilisé l’urine, le lait, la salive parotidienne des animaux, etc., etc. Ces milieux conviennent bien aux espèces parasites qui y trouvent des conditions de nutrition plus voisines de la réalité.

Mais le liquide nutritif qui est surtout employé, c’est le bouillon fabriqué soit avec du bœuf, du veau ou du poulet. <

Les morceaux découpés sont additionnés d’une certaine quantité d’eau (2l:t d’eau pour l1* de viande), puis placés sur un feu doux pendant 2 heures environ. On écüme le bouillon avec soin, et après refroidissement on dégraisse en siphonnant le liquide clair.

Le bouillon est neutralisé avec de la soude caustique, puis soumis a l’ébullition. On filtre sur un filtre mouillé pour retenir la graisse, et on additionne de chlorure de sodium (6*' par litre).

On introduit ensuite le bouillon dans des ballons et on stérilise à l’autoclave, vers 110°.

Je prépare le bouillon de bœuf de la façon suivante :

lks de chair musculaire débarrassée de sa graisse et de ses aponévroses est finement haché à l’aide d’un hachoir mécanique. On ajoute environ 4Ut d’eau par kilogramme de viande et on laisse macérer pendant quelques heures dans un endroit frais; on filtre, puis on soumet la viande retenue par le filtre à une assez forte pression à l’aide d’une presse à main.

Le jus ainsi recueilli est ajouté au liquide initial et le mélange est filtré pour le débarrasser de la majeure partie de la graisse. On place ensuite au bain-marie pendant quelques heures, on filtre sur un filtre mouillé, puis on neutralise avec de la soude, on fait bouillir pendant quelque temps, on filtre de nouveau sur un filtre mouillé et, enfin, on ajoute de 5 à 8*' de chlorure de sodium par litre.

Ce bouillon est ensuite stérilisé à l’autoclave à 110", et filtré jusqu’à ce qu’il passe clair.

Lorsque l'on veut varier les conditions de culture, on peut introduire dans le bouillonnes peptones, du glucose ou bien de la glycérine.

M. Miquel préconise l’adoption d’un même milieu de culture, pour que les essais des divers expérimentateurs puissent être aisément comparés.

La composition de ce bouillon est la suivante :

Peptone . 20ar 0

Sel marin . 5 ’o

Cendre de bois . o ,10

Eau ordinaire . 1.000 ,0

Milieux solides. — Les milieux nutritifs solides sont de beaucoup les plus employés ; ils offrent, en effet, de sérieux avantages dans les recherches bactériologiques.

Parmi les milieux solides, les gelées à base de gélatine sont celles que l’on choisit le plus communément. On se sert pour les fabriquer de gélatines extrafines. La quantité de gélatine employée varie selon les saisons. En hiver, on peut faire de bonnes gelées avec 7*' de gélatine pour 100*' d’eau, tandis qu’en été il est nécessaire de doubler et même de tripler la dose de gélatine.

Pour augmenter la valeur nutritive du milieu, on ajoute des peptones, ou bien on fait fondre la gélatine dans du bouillon de bœuf, de veau, etc.

Parmi les nombreuses recettes qui sont enseignées, en voici une qui fournit de bons résultats :

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Oti laisse tremper 80*' de gélatine dans une certaine quantité d’eau ; lorsque la gélatine est bien ramollie, on la fait fondre dans un litre de bouillon préparé comme nous l’avons déjà dit ; on ajoute ensuite 20*r de peptones sèches, et 5 à 6*r de sel ordinaire.

On neutralise par la soude jusqu'à réaction légèrement alcaline, puis on introduit un blanc d’œuf battu en neige dans un peu d’eau pour clarifier la masse.

On porte le tout à l’autoclave à 110°, puis on filtre à chaud à l’aide d’un entonnoir bain-marie ordinaire. La gelée ainsi recueillie est conservée dans des ballons stérilisés (fig. 15).

Une pareille gélatine fond vers 25°; de là l’inconvénient de ne pouvoir y cultiver des germes qui réclament une température voisine de 37°.

De plus, beaucoup de bactéries liquéfiant la gélatine, il est fort difficile deprocéder à des cultures pures.

On prépare des milieux solides nutritifs qui permettent de cultiver des espèces pathogènes, par exemple, à des températures de 40°. On se sert pour cela de gelose qu’on ajoute soit à de la gélatine, soit à de la peptone, et que l’on utilise seule au lieu et place de la gélatine.

On prépare la gelose de la façon suivante :

La gelose commerciale est soumise à une macération préalable à l’acide chlorhydrique à 6 p. 100; puis, après lavage à grande eau, elle est plongée dans de l’eau contenant 6 p. 100 d’ammoniaque. On lave de nouveau à plusieurs reprises.

La gelose étant ainsi purifiée, on la fait fondre dans de l'eau distillée bouillante, on neutralise avec du bicarbonate de soude, puis on filtre à chaud et on stérilise.

Cette gelée peut être additionnée de glycérine de 1 à 5 p. 100, ou de glucose, ou de tout autre produit, suivant les exigences des espèces qui doivent se cultiver sur un pareil milieu.

Le sérum sanguin offre aussi des avantages appréciables dans certains cas ; quelques bactéries s’y développent plus abondamment que sur les milieux précédents; ce milieu de culture présente pourtant un grand inconvénient : c’est le temps assez long que nécessite sa préparation. Aussi, son usage se restreint-il de plus en plus.

On recueille le sang de l’animal : cheval, chien, lapin, cobaye, etc., dans un vase, et après la rétraction du caillot, on sépare le liquide ambré qui surnage. On porte ce liquide à la température de 65 à 68°, et immédiatement le sérum se solidifie dans les tubes en prenant la position qui leur est donnée.

Fig. 15.

On peut ajouter de la glycérine, de 6 à 8 p. 100, suivant MM. Nocard et Roux, pour éviter la dessiccation de la surface, surtout lorsqu’on désire conserver les tubes quelque temps avant de les employer.

On utilise aussi des milieux végétaux. La pomme de terre fournit très souvent un bon milieu de culture; quelques bacilles pathogènes s’y développent très vigoureusement.

Les pommes de terre sont préparées de la façon suivante :

On choisit des tubercules sains, qu’on pèle et qu’on débite en prismes de 4om de long sur lc“ de largeur et lc“ de hauteur. Ces morceaux de pomme de terre sont lavés dans de l’eau distillée, puis introduits dans des tubes à pommes de terre. Ces tubes, assez larges d’ouverture (2C“ de diamètre environ), portent à la partie inférieure un étranglement, ce qui permet au morceau de pomme de terre de ne pas aller jusqu'au fond du tube, et de recueillir l’eau qui provient de la cuisson du tubercule.

On stérilise les tubes à l’autoclave pendant 10 minutes et on les conserve ainsi pendant assez longtemps.

Le blanc d’œuf cuit peut être aussi débité en prismes et introduit dans des tubes à pommes de terre.

M. Ogier a employé, principalement pour les microbes chromogènes, un milieu de culture qui donne de très bons résultats : la noix de coco.

On détache l’amande à l’aide d’un marteau et, au moyen d’un emporte-pièce en métal, on découpe des rondelles de noix de coco qu’on stérilise dans des tubes à pommes de terre, comme à l’ordinaire.

On peut aussi se servir d’empois, d’amidon, du riz cuit, etc.

Enfin, un milieu de culture qui m’a fourni d’excellents résultats et qui a le très grand avantage de placer les microbes à peu près dans les conditions de milieu réelles, ce sont les fœtus d’animaux abattus pour la boucherie.

Les fœtus provenant de truies sont plus faciles à manier à cause de leurs dimensions assez restreintes. Voici, d’ailleurs, comment on doit opérer.

Les fœtus sont apportés au laboratoire encore enveloppés de leurs membranes ; on les défait aussi rapidement que possible et on les lave à plusieurs reprises avec de l’eau distillée et bouillie.

Les fœtus sont placés dans des flacons stérilisés et sont inoculés avec les cultures à étudier. On pratique facilement l’inoculation en se servant d’un tube de verre fraîchement étiré. »

Méthode des cultures sur plaques. - Cette méthode, établie par Koch, permet d obtenir l’isolement des colonies produites par le développement des bactéries emprisonnées dans la masse de la gélatine refroidie.

Elle permet, en outre de l’obtention de cultures pures et de la numération de ces colonies, l’étude des formes que présentent les colonies issues d’un seul germe.

Ce caractère peut fournir, dans quelques cas, des éléments de diagnose suffisants pour distinguer des germes entre eux.

Si l’on envisage l’examen bactériologique des eaux qui nous occupe ici on comprendra l’importance qu’il y a à obtenir des liquides dilués afin que,’ ces

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