F. BORDAS

liquides étant, mélangés à de la gélatine nutritive fondue, les bactéries emprisonnées dans -l'a masse refroidie soient suffisamment écartées les unes des autres pour que non seulement la numération en soit possible, mais aussi que les colonies am si formées •paissent se développer facilement, sans empiéter les unes sur les autres.

Nous avons, précédemment, indiqué quelles étaient les méthodes suivies pour obtenir le degré de dilution de l’eau à analyser; nous n’y reviendrons pas, et nous ne ferons que décrire ici les moyens employés pour obtenir des cultures sur plaques.

Les plaques qui servent à cet usage sont en verre et proviennent de clichés photographiques 9 x 12 pelles ont été, au préalable, nettoyées à l’acide chlorhydrique, puis lavées soigneusement afin d’en détacher la couche de gélatine.

On les passe à l’alcool en les frottant avec un tampon de papier joseph, puis elles sont stérilisées dans une boite en tôle placée dans un four à flamber.

Ces plaques sont disposées ensuite sur un support parfaitement horizontal, de façon à ce que la gélatine se répande bien uniformément sur toute la surface.

Le support doit aussi remplir une autre condition, c’est de permettre à la gélatine de se prendre en masse assez rapidement.

L’appareil de Iloux offre ces avantages, mais ses dimensions sont trop restreintes.

Le système imaginé par M. J. Ogier est certainement plus approprié aux recherches bactériologiques des eaux. Cet appareil se compose d’un plateau rectangulaire creux muni de vis calantes, afin de le maintenir horizontal, et possédant à ses deux extrémités deux tubulures soudées par où peut passer un courant d’eau froide.

Afin d’éviter que la pression des conduits d’eau de la ville ne déforme la partie inférieure du plateau creux, on a soin de placer entre la prise d’eau et la tubulure d’entrée un flacon en verre à deux tubulures, pour régulariser la pression (fig. 16).

Ce plateau peut recevoir six cloches et permet ainsi de faire au moins 12 plaques en même temps.

Lesplaques, préparées comme nous venons de le dire, sont de nouveau flambées à l’aide d’une lampe à alcool et placées enfin sous les cloches.

Des tubes contenant 10" de gélatine nutitrive, maintenus à uneSdouce température, de façon à conserver la fluidité de la gél^rm»acéalablement ensemencée, sont coulés sur les plaques disposées comme ci-dessus. La gelée s’étale lentement et uniformément, et ne tarde pas à se solidifier.

On peut abandonner ainsi les plaques à elles-mêmes, ou bien, lorsque la gélatine est prise, les placer dans des cristallisoirs couverts et stérilisés, sur de petites étagères, de façon à pouvoir en, mettre plusieurs à la fois.

La cloche est portée ensuite à l’étuve réglée à 16 ou 18°. Cette méthode a un inconvénient assez grave que voici : étant données les diverses manipulations que l’on fait subir aux plaques, on ne peut éviter les poussières atmosphériques.

M. Esmarch a modifié le procédé primitif de Koch de la façon suivante :

Les dilutions sont faites dans des tubes de gros diamètre, et au lieu de verser la gélatine contenue dans ces tubes sur des plaques de verre, on la solidifie à l’intérieur des tubes mêmes en plaçant ces derniers sous un robinet d’eau froide et en les maintenant inclinés tout en leur imprimant un mouvement de rotation.

Ce procédé permet, en effet, de se mettre à.l’abri des poussières de l’air; mais, outre qu’il rend difficile l’examen des colonies au microscope, il offre l’inconvénient de ne pas pouvoir être employé pour les analyses d’eau, par exemple, à cause de la présence fréquente de germes liquéfiant la gélatine.

Culture dans l’organisme vivant. — L’organisme vivant offre des affinités très grandes pour certaines espèces de bactéries pathogènes, affinités qui peuvent être telles que dans un mélange de plusieurs espèces il se produise une véritable séparation, et que certaines bactéries se développent à l’exclusion de toutes les autres. Cette méthode de culture appartient à Pasteur, et c’est grâce à elle que Pasteur a découvert le vibrion septique.

L’expérimentation physiologique est indispensable pour déterminer le caractère pathogène de certaines bactéries : car les troubles profonds produits dans l’organisme permettent de mettre en évidence les caractères propres à quelques bactéries.

Nous ne pouvons pas indiquer ici les moyens usités dans l’expérimentation physiologique, ni décrire les règles suivies en pareil cas; il faudrait se reporter aux traités spéciaux de physiologie et d’anatomie pathologique.

Nous nous bornons à appeler sur ce point l’attention de ceux qui s’occupent plus spécialement de l’analyse des eaux, et à insister sur cette méthode de la culture dans l’organisme vivant, car elle seule peut fournir le critérium indiscutable entre le parasite et la maladie.

Culture des germes anaérobies. — La doctrine de l’anaérobiose, due à Pasteur, qui la découvrit en 1861, ne fut pas admise sans conteste par tous, et principalement en Allemagne. Mais les recherches ultérieures ne tardèrent pas à confirmer cette découverte, et on s’aperçut que l’anaérobiose est un phénomène très caractéristique et plus fréquent qu’on ne le pensait.

EADX POTABLES. — F. BORDAS

Lorsqu’on procède à l’analyse bactériologique d’une eau, il est, à notre avis, tout aussi important de cultiver les microbes anaérobies que ceux qui sont aérobies, et cela pour plusieurs raisons. La première, qui est déjà suffisante, est que beaucoup de ces germes anaérobies sont des microbes pathogènes (œdème malin, tétanos, vibrion septique, charbon symptomatique, etc.); la seconde, c’est qu’une numération faite autrement enlèverait encore un peu du faible intérêt que présente cette susdite numération.

La technique des cultures anaérobies est très simple en théorie, mais beaucoup plus difficile à mettre en pratique, témoin les nombreux procédés qui ont été préconisés pour placer les cultures à l’abri de l’oxygène atmosphérique, ou de l’oxygène qu’absorbent les milieux de cultures.

On a essayé de recouvrir les cultures avec du mica, du verre, de la vaseline, de l’huilé, ou bien d’enlever l’air et de le remplacer par de l’hydrogène, de l’acide carbonique, du gaz d’éclairage, etc. De tous ces procédés celui qui est à l’abri des principales critiques est le suivant, préconisé par Roux :

Il consiste à faire le vide dans un tube de gélatine ensemencée, maintenue liquide à une douce température; à l’aide d’un robinet à trois voies, on laisse pénétrer de l’hydrogène, on refait le vide et on introduit de nouveau le même gaz hydrogène. On répète celte manœuvre plusieurs fois, puis on étire le tube et on le scelle à la lampe.

En étendant ensuite la gélatine sur les parois du tube, comme dans le procédé Esmarch, on peut pratiquer la numération.

La séparation des colonies anaérobies est assez facile par ce procédé; mais si l’on désire étudier les caractères des colonies, il est nécessaire de les cultiver par des méthodes plus aisées et moins longues.

Les cultures faites par piqûre profonde dans des tubes de gélatine donnent d’assez bons résultats, à la condition d’employer une certaine masse de gélatine, de faire la piqûre avec un fil de platine très fin et, enfin, de recouvrir la surface de la gélatine par une couche de oc d'huile d’olive stérilisée par l’ébullition.

Un autre procédé très élégant, préconisé par M. Roux, consiste à faire absorber par des germes aérobies l’oxygène contenu dans un tube à essai ensemencé avec des microbes anaérobies.

Enfin, on peut préparer des pommes de terre et y faire développer des cultures de microbes anaérobies en opérant d’une façon identique à celle que nous préconisions pour la gélatine, c’est-à-dire à l’aide du vide et d'un courant d’hydrogène (Roux).

Méthodes de coloration.

L’examen direct des micro-organismes à l’aide du microscope est une opération qui présente quelques difficultés, à cause de la petite dimension des bactéries, de leur mobilité et de leur faible réfringence. On n’a pu étudier les caractères propres à certaines bactéries, les différencier les unes des autres, en découvrir même qui étaient passées inaperçues auparavant dans les préparations, qu’à l’aide de la méthode de coloration par des réactifs appropriés, et surtout par l’emploi des couleurs d’aniline.

Il existe, pour déceler la présence des bactéries, beaucoup de procédés de coloration basés sur des colorants autres que des dérivés de la houille, mais ces procédés ne sont pas toujours suffisants et ne donnent pas des préparations aussi parfaites que celles qui sont obtenues à l’aide des couleurs d’aniline.

Les couleurs basiques sont employées de préférence aux couleurs acides : car elles semblent être fixées plus fortement et produisent, parce fait, un plus grand contraste entre les bactéries et le fond de la préparation.

Certains auteurs emploient de préférence le violet de méthyle ou le violet de gentiane; quelques-uns, le bleu de méthylène ou la vésüvine; d’autres, enfin, se servent de vert de méthyle ou de noir d’aniline.

Toutes ces matières colorantes peuvent être employées avec un égal succès; mais nous préférons, avec nombre de bactériologistes, l’usage de la fuchsine rubine, qui permet d’obtenir des contrastes beaucoup plus nets.

On emploie la rubine en solution aqueuse et en solution alcoolique. La première est d’un usage préférable lorsque l’on veut étudier les bactéries vivantes ; on la prépare de la. façon suivante :

On fait dissoudre 10^ de rubine dans 200e1 d’eau distillée, on filtre et on conserve dans un flacon compte-gouttes; mais comme cette solution ne demeure pas longtemps exempte de micro-organismes, certains auteurs, pour obvier à cet inconvénient, préfèrent préparer leur solution aqueuse de rubine au moment de s’en servir.

On place, dans ce cas, quelques grammes de rubine sur un petit filtre, dans un entonnoir de verre, et on verse de l’eau distillée stérilisée au moment de s’en servir; on obtient ainsi une solution aqueuse à peu près exempte de germes étrangers.

La solution alcoolique de rubine se prépare en faisant dissoudre de la rubine dans de l’alcool absolu (20sr de rubine dans 100*1 d’alcool absolu).

On obtient ainsi une solution très concentrée que Fig. 17. l’on conserve dans un flacon

compte-gouttes (fig. 17).

Le modèle de compte-gouttes dont nous nous servons possède quelques avantages, entre autres de ne pas laisser évaporer la solution qui s’y trouve d’empôcher que la matière colorante ne se dépose sur les parois du bouchon et, enfin, d’éviter la souillure par les poussières de l'air.

Ce compte-gouttes se compose d’un flacon de 200~ dont le goulot est rodé extérieurement; le bouchon est formé d’une ampoule en verre rodée intérieurement à sa partie. inférieure, et qui ferme hermétiquement sur le goulot du flacon. Au sommet de l’ampoule se trouve soudé un tube de verre effilé qui plonge presque jusqu’au fond du flacon, et qui dépasse le point de soudure avec

EAUX POTABLES. — F. BORDAS 51

l’ampoule de 0m,4 environ. Un petit bouchon en caoutchouc ferme l’orifice supérieur du. tube.

On a eu soin, afin de maintenir l’égalité de pression entre l’extérieur et l’intérieur du flacon, lorsque celui-ci est fermé, de percer un petit trou dans l’ampoule en verre, un peu au-dessous du grand diamètre de cette ampoule.

On peut ainsi conserver des solutions alcooliques de couleurs d’aniline sans crainte de les voir se détériorer.

L’étude des colonies qui se sont développées sur les plaques de culture nécessite une technique spéciale permettant l’examen rapide des bactéries composant ces différentes colonies.

Le montage des préparations est, en général, une opération assez longue qu’on peut abréger considérablement en procédant comme il suit :

Une parcelle de la colonie à examiner étant enlevée à l’aide d’un fil de platine préalablement flambé, on l’étale sur la lame du porte-objet, on verse à côté une goutte de la solution de rubine aqueuse, et on mêle à l’aide du fil de platine le liquide colorant à la parcelle de colonie. On recouvre avec une lamelle et on attend quelques minutes pour permettre aux bactéries de fixer la matière colorante.

Pendant ce temps, on fait une préparation semblable avec une autre colonie; celle-ci terminée,' on examine la première et on en note les principaux caractères.

Si, à l’inspection de la colonie, de sa forme, de sa couleur, et si après l’examen microscopique rapide on conserve des doutes sur le caractère de la bactérie, on en prélève une autre parcelle que l’on cultive dans des tubes de gélatine, etc., et qu’on examine ensuite à loisir par d’autres procédés de coloration que nous indiquerons plus loin.

Pour cet examen sommaire, suffisant dans la grande majorité des cas, il est préférable d’employer de la rubine aqueuse; mais, lorsqu’il s’agit de faire dés préparations pour la photographie, par exemple, il faut se servir de la solution alcoolique de rubine.

Voici comment on procède :

La parcelle de culture est déposée sur la lame du porte-objet, puis desséchée sur la table chauffante de M. Ogier. On verse ensuite une goutte de la solution alcoolique de rubine, on évapore à sec, puis on plonge la préparation à plusieurs reprises dans un verre à pied contenant de l’eau distillée; lorsque le liquide ne se colore plus, on sèche la préparation et on monte sur baume.

Cette technique est applicable à tous lès autres colorants de la houille. Dans certains cas, on est obligé d’employer des mordants pour fixer la matière colorante sur les bactéries,

Loffler et Koch se servent d’une solution de 03>,01 de potasse'p. 100.

Ziehl prend une solution à 5 p. 100 d'acide phonique, et, enfin, d’autres bactériologistes se servent d’acide gallique, de tanin, de sulfate de fer, etc., etc.

La solution de Ziehl est ainsi composée :

Fuchsine. . . .

.Acide sphénique

Koch est le premier qui ait préconisé l’usage des solutions alcalines. Sa formule primitive était la suivante :

Solution alcoolique concentrée de bleu de méthylène. lvo1

Solution de potasse à 10 p. 100 . 2'01

Eau distillée . 200”1

mais elle avait l’inconvénient de déformer les bactéries par le gonflement ou bien de détacher la mince pellicule de matière fixée sur la lamelle par la dessiccation.

M. Erlich a modifié la formule de Koch en substituant l’eau d’aniline à la potasse. 11 prend donc :

Solution alcoolique de violet de méthyle . 10“

Alcool absolu . 10"

Eau d’aniline . 100“

On peut préparer séparément l’eau d’aniline et la conserver dans un flacon jaune :

Huile d’aniline . 3,jr

Eau distillée. . 100,r

On agite fortement et on filtre sur un filtre mouillé, de façon à retenir les gouttelettes d’huile non dissoutes.

Certaines bactéries retiennent très fortement la matière colorante; d’autres, au contraire, l'abandonnent plus ou moins totalement suivant les réactifs employés.

Ce caractère des bactéries de se décolorer avec tel ou tel réactif permet de différencier quelques espèces.

Koch a préconisé, dans ce but, l’alcool dilué :

Alcool . 60 parties.

Eau . 40 —

La méthode de Gram n’est pas, à proprement parler, une méthode de décoloration ; l’iode qui s’y trouve est plutôt un fixatif, et la décoloration est obtenue par le lavage ultérieur à l’alcool :

Iodure de potassium. . .

Eau distillée . 30o»r

Voici comment on doit pratiquer la méthode de décoloration de Gram :

On colore la préparation pendant quelques minutes avec une solution de violet de gentiane composée de :

Solution alcoolique saturée de violet de gentiane. . . g"

Eau d’aniline . ' lo0«

On la plonge ensuite dans la solution iodée, jusqu’à ce que la préparation soit devenue noire, ce qui exige quelques minutes; puis on lave dans l’alcool jusqu’à complète décoloration. La préparation est ensuite montée sur baume.

EAUX POTABLES. — F. BORDAS

A ces différentes méthodes on a joint ensuite celle des doubles colorations, basée sur la propriété que possèdent certains micro-organismes de retenir d’une façon très énergique la matière colorante, tandis que d’autres, au contraire, sous l’influence des mêmes colorants, abandonnent leur matière colorante et sont, par ce fait, susceptibles de se colorer de nouveau par un autre colorant.

C’est grâce à cette méthode que Koch a pu distinguer le bacille de la tuberculose des autres espèces avec lesquelles il se trouve presque toujours mêlé.

La formule de Kock a été modifiée par M. Fraenkel de la façon suivante:

La préparation ayant été colorée par la méthode d’Erlich, on la soumet, après lavage, à l’action du mélange suivant :

Alcool . 50ïr

Eau distillée . 30gt

Acide azotique . 203'

en ajoutant du bleu de méthylène si le colorant primitif d’Erlich était à base de fuchsine, et de la vésuvine si elle était faite avec du violet de méthyle.

La méthode de la double coloration permet aussi de colorer les bacilles et les spores qui sont contenus dans l’intérieur des bacilles eux-mêmes.

On utilise l'action prolongée de la chaleur, qui a pour effet d’empêcher la coloration de la cellule, tandis qu’au contraire les spores qui sont contenus dans l’intérieur des bactéries sont susceptibles de se colorer par les solutions aqueuses ou alcooliques diluées.

Après la coloration des spores, on peut colorer les bactéries par lin autre colorant et obtenir ainsi des préparations très nettes.

% Enfin, il est quelquefois utile de rechercher la présence des flagella chez des bactéries, pour les distinguer d’autres espèces. La méthode de Lofller est celle qui est le plus généralement employée, elle donne d’assez bons résultats et n’a guère que l’inconvénient d’être d’une manipulation longue et délicate.

Elle consiste : i° à chauffer modérément la préparation; 2° à mettre sur la face enduite une goutte du mordant suivant :

Solution aqueuse d’acide gallique (20 p. 80) . 10“

Solution de sulfate de fer saturée à froid ....... 5“

Solution alcoolique de fuchsine . 1“

3° à chauffer de nouveau la lamelle jusqu’à dégagement de vapeur ; 4“ à laver à l’eau, puis à l’alcool; 5° à colorer avec une solution de fuchsine aniline; 6° à chauffer et à laver à grande eau à plusieurs reprises, et 7° enfin à monter sur baume.

La méthode suivante est tout aussi longue, mais elle a l’avantage de fournir de belles préparations où les flagella se distinguent très nettement.

On prépare d’abord les solutions suivantes :

1" solution.

Acide osrnique, à . . 2 p. 100

2* solution .

Tanin, à . 20 p. 100

3° solution.

Nitrate d’argent, à . 0,2 p. 100

4° solution.

Acide gallique . S

Tanin . 3

Acétate de sonde fondu . 10

Eau . 350

Pour étudier les flagella du bacille d’Eberth, par exemple, ou prend une culture récente (de 24 heures) faite sur agar et maintenue à 37°;

On délaye un peu de la culture dans de l’eau sur une lamelle et on se sert de celte dilution pour étaler sur d’autres lamelles.

On sèche à l’air ou bien en chauffant avec précaution, puis on fait un mélange composé de 2vo1 de la solution au tanin et •dT°1 de la solution à acide osmique ; on recouvre les lamelles avec ce liquide noir et on abandonne le tout pendant 4 heures.

On lave ensuite à l’eau et à l’alcool et on plonge ensuite les préparations pendant 5 minutes dans la solution de nitrate d’argent; puis, sans laver, on plonge les lamelles dans la solution d’acide gallique en agitant constamment, on remet les lamelles dans le nitrate d’argent, toujours sans les laver, jusqu’à ce que ces dernières aient pris une teinte grise et que le bain d’argent brunisse, on sèche et on monte ensuite dans le baume.