Examen chimique

L’examen chimiqne comprendra :

a) L'identification et le dosage des substances protéiques.

b) La recherche et le dosage de la dextrine.

c) Le dosage et l'examen des cendres.

d) Le dosage de l'eau.

e) Le dosage de l'acidité.

a) Identification et dôsage des substances protéiques. — Définition. — Les matières protéiques ou albuminoïdes, peuvent être considérées comme des nitriles complexes à poids moléculaires très élevés, aptes

à s’hydrater sous l’influence des ferments, des acides ou des alcalis étendus et formés essentiellement de carbone, d’hydrogène, d’oxygène, d’azote et de soufre ; outre qu’elles dévient à gauche, le plan de la lumière polarisée, elles présentent des réactiops de coloration et des réactions de précipitation.

C’est à l’aide de ces derniers caractères que nous avons caractérisé, isolé et dosé en partie les substances protéiques contenues dans les miels.

A. — Essai qualitatif. — Action de la chaleur. — La chaleur coagule les substances albuminoïdes naturelles, en milieu acide et en présence de sels. On dissout à froid 10 gr. de miel dans 50 cc. d’eau distillée et on filtre. On ajoute à la solution à étudier 6 gr. de chlorure de sodium ou de sulfate de magnésie, quelques gouttes d’acide azotique ou d’acide acétique et on porte à l’ébullition. Un trouble même léger, ne disparaissant pas par addition d’un nouvel excès d’acide ou un précipité floconneux, indique la présence de matières albuminoïdes.

Si l’on veut vérifier que l’on a bien affaire à des matières protéiques, on recueillera sur un filtre sans plis ce précipité, on le lavera à l’eau distillée, on percera le filtre et à l’aide du jet d’une pissette, on fera passer le préeipité dans un tube d’essai.

On fera alors les deux réactions de coloration suivantes :

oc) Réaction xanthoprotéique. — On ajoute à la substance albuminoïde supposée, en suspension dans l'eau, quelques gouttes d’acide azotique et on porte à l’ébullition ; les flocons albuminoïdes et la solution elle-même prennent bientôt une coloration jaune. Abandonnons au refroidissement et faisons couler à la surface du liquide

contenu dans le tube une solution d’ammoniaque ; les flocons albuminoïdes de la partie supérieure du liquide alcalinisé se colorent en jaune-orange, tandis que les flocons des couches inférieures du liquide restent colorés en jaune. Si nous mélangeons, flocons et solution se colorent uniformément en jaune orange.

(S) Réaction de Millon. — La substance albuminoïde en suspension dans l’eau est additionnée de 1 gr. de réactif de Millon. On porte à l’ébullition. Les' flocons albuminoïdes se colorent rapidement en rouge foncé.

Préparation du réactif. — Dissoudre 1 gr. de mercure dans 2 cc. d’acide azotique de D : 1,42, d’abord à froid, élever légèrement la température, et lorsque tout le mercure a disparu, ajouter à 1 volume de cette solution 2 volumes d’eau.

II) . Action de l'acide azotique. — On verse dans un tube à essai ou dans un verre à expérience de l’acide azotique et on fait couler à l’aide d’une pipette, à la surface de l’acide azotique, la solution de miel à examiner ; il se fait plus ou moins vite, selon la plus ou moins grande quantité de matières albuminoïdes, un anneau blanc à la surface de séparation des deux liquides.

III) . Action de l'acide trichloracétique. — On ajoute goutte à goutte de l’acide trichloracétique (solution à 30 °/o). On a un précipité blanc.

IV) . Action du ferrocyanure de potassium et de l'acide acétique. — On prend la solution de miel ; on y ajoute 1 cc. d’acide acétique et autant de ferrocyanure de potassium en solution concentrée. Il se fait un louche, suivi d’un dépôt floconneux.

V) . Action du tannin. — Une solution de tannin à

4 ‘’/oi ajoutée à la solution de miel, donne un précipité s’agglomérant en flocons et dont l’intensité est en rapport

avec la quantité d’albumine en présence.

VI). Action du réactif d'Esbach. — La solution picrique d’Esbach se prépare en prenant :

Acide picrique. 1 gr.

Acide citrique. 2 gr.

Eau. 10 gr.

Ce réactif versé dans la solution de miel, donne un précipité jaune se réunissant plus ou moins vite au fond du tube dans lequel on a tait l’essai.

VII). Action du réactif de Tanret. — La solution d’iodhydrargyrate de potassium se prépare avec :

Chlorure mercurique. 2 gr. H

lodure de potassium.. 8 gr. 187

Acide acétique crist.. 31 cc.

Ce réactif, excessivement sensible, précipite outre les albuminoïdes (albumine proprement dite et globuline), les peptones, mais la chaleur fait disparaître le précipité dû aux peptones.

La présence incontestable des matières albuminoïdes étant établie, il était intéressant de rechercher à quel genre de matière protéique on avait affaire.

Tout d’abord, la substance albuminoïde, coagulable par la chaleur, précipitant par l’acide trichloracétique, le tannin, etc., est-elle une albumine ou une globnline ou un mélange des deux ?

Un seul caractère permet de les différencier nettement ; il est relatif à leur solubilité dans l’eau ou dans les dissolutions salines : A) l’albumine est soluble dans l’eau

pure ; le sulfate de magnésie à saturation ne la précipite pas de ces solutions neutres. B) La globuline, par contre, est insoluble dans l’eau pure, mais soluble dans les solutions salines faibles de sulfate de magnésie ; le sulfate de magnésie à saturation la précipite de ces solutions.

Pour appliquer cette double propriété aux albumines naturelles des miels, on neutralise avec une solution de soude en présence de phtaléine du phénol, une solution de miel à 10 p. 30 d’eau et on sature le mélange de sulfate de magnésie. Un louche, presque immédiat suivi après quelques heures d’un précipité floconneux, indique la présence de globuline.

Le liquide séparé de la globuline par filtration, acidulé par quelques gouttes d’acide acétique, est porté à l’ébullition. L’existence d’albumine est révélée par le précipité floconneux qui se fait de suite.

- Si maintenant on sépare ce second précipité du liquide dans lequel il est contenu, et que l’on ajoute au liquide filtré une solution en excès de tannin, de réactif citro-picrique, de réactif de Tanret. . ., on constate un trouble et après 24 heures un dépôt floconneux. Il est donc permis de croire que l’on se trouve en présence de protéoses vraies ou de peptones ou des deux à la fois.

Recherches des protéoses vraies ou alhumoses. — On reprend un nouvel échantillon de miel, on le met en solution, on filtre et on coagule les matières albuminoïdes naturelles par la chaleur après avoir acidulé et ajouté du chlorure de sodium. On filtre. Le liquide filtré est saturé de sulfate d’ammoniaque à chaud ; on abandonne au repos et après 24 heures, le précipité formé

est recueilli sur un filtre. On le lave avec une solution saturée de sulfate d’ammoniaque et on le fait passer dans un tube à essai, à baide du jet d’eau chaude d’une pissette, après avoir percé le filtre.

On pourra se convaincre de la présence des albnmoses en faisant la réaction du biuret ou en précipitant par le tannin acétique (après dilution), on le réactif de Tanret on le réactif d’Esbach.

Ces différents précipités sont solubles à chaud, alors que ceux dus aux albumines naturelles ne le sont pas.

Dans la solution saturée de sulfate d’ammoniaque et débarrassée du précipité d’albumoses, on pourra rechercher les peptones, s’il y en a, par la réaction du biuret.

B. — Essai quantitatif. — Dosage des matières albuminoïdes. — On dosera :

1“ Les matières albuminoïdes coagulables par la chaleur.

11“ Les matières albuminoïdes de transformation.

III“ Les matières albuminoïdes totales.

Les méthodes des « dépôts « (méthode d’Esbach, méthode de Lnnd), manquant de précision dans le cas d’analyses délicates, on devra reconrir au procédé gravimétrique.

1“ Dosage des albumines coagulables par la chaleur. — On dissent 10 gr. de miel dans 50 cc. d’ean distillée. Après filtration, on ajoute 6 gr. de chlorure de sodium ou de sulfate de magnésie et quelques gouttes d’acide azotique ou d’acide acétique. On porte à l’ébullition qu’on maintient une minute dans nn vase à précipitation chaude, en agitant constamment. On laisse refroidir afin d’avoir nn précipité bien rassemblé.

Pour le recueillir et le peser, on emploie la méthode des « filtres pesés » ou des « filtres tarés. »

a) Filtres pesés. — On dessèche à l’avance un filtre à l’étuve de 100° et on l’introduit dans un flacon à tare bouchant à l’émeri. Après une demi-heure environ, on retire de l’étuve et on ferme le flacon. Après refroidissement on pèse. On remet à l’étuve en laissant entr’ouvert la fiole ; on fait une seconde pesée après quelque temps, et lorsque le résultat reste constant, le filtre est prêt à servir.

jS) Filtres tarés. — Deux filtres égaux sont faits avec le même papier. On enlève de petites portions à l’un d’eux, jusqu’à ce qu’ils se fassent exactement équilibre sur le plateau de la balance. On fait la filtration dans les deux filtres emboîtés l’un dans l’autre, en perçant au besoin le filtre extérieur pour ne pas retarder la filtration.

Le ou les filtres ainsi prêts, on verse le précipité dessus et on le lave à l’eau chaude, jusqu’à ce que l’eau de lavage ne précipite plus par l’azotate d’argent ou par le chlorure baryum (selon que le sel ajouté est NaCl ou SO* Mg). On rince à l’alcool et finalement à Léther. On desséche à l’étuve à 100”, une heure et on pèse.

Remarques .— 1) Il est nécessaire d’ajouter du chlorure de sodium ou du sulfate de magnésie si l’on veut avoir une précipitation complète, le miel étant pauvre en sels minéraux (Voir analyses, p. 40 et 41).

2) La réaction doit être faiblement acide. Un trop grand excès d’acide acétique par exemple, transformerait à l’ébullition les matières albuminoïdes naturelles en acidalbumines solubles ; par contre, en liqueur alcaline ou neutre, on n’aurait pas non plus une précipitation parfaite.

MOREAU. 3

3) Enfin, une correction nécessitée par la pré'îence des sels est nécessaire. En effet, les matières minérales des miels et les sels ajoutés pour favoriser la précipitation peuvent être englobés dans le coagulum. On incinérera donc le filtre chargé d’albumine et on déduira le poids des cendres de la quantité d’albumine brute primitivement obtenue.

Dosage de la globuline et de l'albumine. — 100 gr. de miel sont mis en solution dans 50 cc. d’eau. On neutralise en présence de phtaléine de phénol à l’aide N

d’une solution tk de NaOH ; on sature à troid le liquide

de sulfate de magnésie. On abandonne 24 heures au repos et on jette sur un filtre taré. On lave ce précipité avec une solution saturée de SO* Mg. Le filtre et le précipité sont portés à l’étuve à 100° ; les globulines sont ainsi coagulées. On lave ensuite à l’eau distillée pour enlever le sulfate de magnésie imprégnant le filtre et le précipité. On reporte le tout à l’étuve à 100“ pour dessécher et on pèse. La liqueur saturée de sulfate de magnésie et les eaux de lavage sont réunies. On acidulé par l’acide azotique ou l’acide acétique et on porte à l’ébullition ; la sérine est ainsi précipitée. On la jette sur un filtre taré, on lave à l’eau distillée chaude, à l’alcool et à l’éther et on pèse. Mais connaissant le poids total de l’albumine (albumine et globuline), on peut se contenter de peser la sérine et de déduire la globuline.

11“ Dosage des matières albuminoïdes de transformation. — Le dosage de ces éléments pourra se déduire facilement : par différence, puisque l’on connaît le poids d’albumine coagulable par la chaleur d’une part, et la

quantité d’azote totale calculée en matières albuminoïdes d^autre part.

III” Dosage de l azote total. — Nous nous sommes servis de la méthode Kjeldhal : 5 gr. de miel sont dissous dans une certaine quantité d’eau ; on jette sur un filtre pour retenir le pollen (1) et les débris divers. On lave convenablement le filtre à l’eau distillée et on évapore à feu doux ou BM, jusqu’à consistance sirupeuse, dans le ballon même où se fera l’attaque. On opère avec 50 cc. d’acide sulfurique et 1 gr. de mercure. Lorsque la liqueur est incolore ou tout au moins limpide, on continue 1 operation selon la méthode habituelle en saturant par de la soude décarbonatée. On précipite ensuite le mercure, soit avec quelques centimètres cubes de solution concentrée de sulfure de sodium ou avec 1 gr. environ d’hypophosphite de soude, préalablement dissous dans un peu d’eau (Maquenne et Roux).

On recueillera l’ammoniaque dans 20 cc. d’une solution d’acide sulfurique déci-normale ; on titrera ensuite

l’acide non combiné avec une solution — de soude.

Le poids d’azote se calculera en multipliant le nombre de centimètres cubes d’acide sulfurique saturés par l’ammoniaque, par le coefficient, 0,0014.

Mais comme on se trouve en présence de petites quantités de matières azotées, si l’on veut avoir un dosage très exact, on aura avantage à recourir au procédé de M. A. Villiers :

On recueille l’ammoniaque dans de l’acide chlorhy-

Voir azote total de certains pollens, p. 43.

drique (2 à 3 cc. pour 15 à 20 cc. d’eau); l’ammoniaque est ainsi à l’état de chlorhydrate en présence d’un excès d’acide chlorhydrique. Cette solution est évaporée à sec au bain-marie, dans une capsule de porcelaine ; le résidu est repris par un peu d’eau et filtré dans un vase cylindrique en verre de Bohême (Becherglass) de 100 cc., en y ajoutant l’eau de lavage de la capsule et du filtre. On termine l’évaporation et la dessication dans une étuve à 105”. On pèse la fiole; l’augmentation de poids multiplié par 0,26168, donne le poids d’azote correspondant. On transforme ensuite en matières albuminoïdes en multipliant le poids d’azote obtenu par le coefficient 6,36.

h) Dosage de la dextrine. — Nous avons employé le procédé suivant, basé sur la précipitation des matières dextrinoformes par l’alcool.

Mode opératoire. — On dissout 10 gr. de miel dans quelques centimètres cubes d’eau distillée au bain-marie et on verse gontte à goutte le miel ainsi fluidifié dans une fiole contenant 100 cc. d’alcool à 95°. Cette quantité est suffisante pour précipiter totalement les dextrines du miel ; on s’assurera toutefois qu’il n’y a plus de précipité en ajoutant un peu d’alcool.

On abandonne au repos 24 heures et on jette ensuite sur un filtre pour recueillir la dextrine et les autres substances précipitables par l’alcool (matières albuminoïdes...). On lave avec 10 cc. d’alcool absolu et on dissout le précipité au moyen du jet d’eau chaude d’une pissetle.

On ne peut doser directement la dextrine en la précipitant à nouveau par l’alcool et en recueillant sur un

filtre taré, car il reste toujours un peu de matière sucrée et on aurait ainsi une erreur par excès.

On évapore la solution de dexüûne contenue dans une capsule tarée, au BM d’abord, puis dans une étuve de Gay-Lussac à 90°. Lorsque deux pesées successives sont identiques, on retire de l’étuve.

On a ainsi un poids P de dextrine et de, sucres. On dissout ensuite le tout au moyen d’eau distillée chaude, de façon à avoir environ 40 cc. de liquide. On fait passer dans une fiole jaugée de 50 cc., on ajoute V gouttes de HCl et on porte au bain-marie pour invertir le saccharose (voir méthodes p. 23).

On complète à 50 cc., avec les eaux de lavage de la capsule et on dose les sucres réducteurs au moyen de 5 cc. de liqueur de Fehling, en ajoutant au préalable dans le vase où se fait la réaction, quelques centimètres cubes de lessive de soude. On a alors, en faisant les calculs, le poids p des sucres réducteurs.

La différence P ^— p, donne la quantité de dextrine contenue dans 10 gr. de miel.

c) Dosage de l’eau. — On verse 10 gr. de miel dans une capsule tarée avec un petit agitateur en verre, quelques grammes de pierre ponce calcinée ou de verre pilé, ou de sable lavé et calciné. On divise la matière sucrée au moyen de l’agitateur et on porte le tout à l’étuve, à 70-80°, jusqu’à poids constant. L’augmentation de poids de la capsule multipliée par 10, donne la quantité d’eau contenue dans 100 gr. de miel.

Autre procédé. — On pourrait également employer le procédé adopté par la Société suisse de chimie analy-

— astique (1). Pour cela : on dissoudrait 10 gr. de miel dans une quantité suffisante d’eau pour obtenir 50 ce. ; on prélèverait 5 cc. de cette solution que l’on verserait dans une capsule plate tarée, contenant du sable ou de la poudre de verre ; on évaporerait an bain-marie en consistance sirupeuse, puis on dessécherait pendant 16 heures à l’étuve.

Connaissant d’une part, le poids de miel qu’on a dissous et le volume qn’on en a fait; d’autre part, sachant que du volume qu’on a pris de cette liqueur, on j rapporte le poids de miel qui y est contenu, on calcule l’humidité pour cent.

Il serait préférable de substituer à ces deux procédés une méthode basée sur la dessication dans le vide, à la température de 60-70°, pendant 24 à 48 heures, pour éviter toute altération des produits sucrés (2). Toutefois, l’emploi de l’étuve donné des résultats satisfaisants dans la pratique, surtout dans le cas d’analyses comparatives.

d) Dosage de l’acidité. — On dissout 20 cc. de miel dans 50 cc. d’eau distillée environ, on filtre, on lave le filtre avec 20 cc. d’eau tiède et on titre en présence de

phtaléine du phénol au moyen d’une solution — de potasse.

Dans le cas de miels colorés, il sera utile de décolorer la solution au noir animal si l’on veut voir nettement le

virage. ^

Chaque centimètre cube de KOH —,

correspond à

(1) Pharm. Zeitung. xxxix, p. 198, 1891.

CauTcet Charron. Chemical News, 1903. 87 (19q-196), (210-212).

0,0023 d’acide formique, l’acidité étant généralement évaluée par rapport à cet acide.

Remarques. — K. Farnsteiner (1) propose d’évaluer provisoirement les acides fixes du miel en ac. malique et de calculer le degré d’acidité en centimètres cubes normaux pour 100 gr. de miel. Nous avons en effet constaté qu’en portant à l’ébullition pendant 10 minutes une solution de miel, ou en laissant un miel une heure à l’étuve à 100°, on obtient une différence avec le premier essai en faisant un nouveau titrage acidimétrique.

e) Dosage et examen des cendres. — Dosage total des cendres. — On pèse 10 gr. de miel dans une capsule de platine tarée, on chauffe très doucement au début pour éviter à la masse qui se boursoufle, de passer par dessus les bords.

Lorsque la plus grande partie de l’eau est évaporée, que le miel a l’aspect d’un sirop épais, on carbonise à la température la plus basse possible. On épuise alors le charbon à l’aide d’eau bouillante, on fdtre sur un filtre sans cendres que l’on met ensuite dans la capsule et on continue l’incinération.

Lorsque toute trace de charbon a disparu, on arrête le feu, on laisse refroidir la capsule et on y verse ensuite la solution aqueuse. On évapore an bain-marie et on porte au rouge sombre ensuite. On laisse refroidir dans un dessicateur et on pèse.

Examen des cendres. — Sur les cendres obtenues on fait un examen qualitatif et quantitatif en appliquant les méthodes employées en analyse (Voir p. 45, résultats de l’examen des cendres.

(1) Z. Untersuch, Nahr, u. g. Mittel, 1898, xv, S98-604.

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