DIGESTION DU SUC DE LEVURE

Durée

de la digestion

Azote non coagulable ®/o de l’azote total

Bases formées °/o Azote précipitable par P. P. T.

Acides formés °/o Azote nonprécipitable par P. P T.

Au début ....

Après 24 heures . .

» 2 X 24 heures

CO

Au début, 1/3 seulement de l’azote total du liquide se trouve sous forme d’azote non coagulable; dans le liquide débarrassé de la partie coagulable, on trouve que sur 100 d’azote en solution, 32.4 sont précipitables par l’acide phosphotungstique et composés presque exclusivement de bases, comme l’histidine, l’arginine, la lysine, etc., les peptones ne s’y trou-

TRYPSINES D’ORIGINES DIVERSES.

vant point et la quantité d’albumose étant très minime. Après 4 jours d’autodigestion, quand l’azote coagu'able a complètement disparu, on trouve de nouveau le même rapport entre l’azote base et l’azote acide. Au contraire, dans le travail pepsique comme dans celui de la trypsine, on observe une tout autre marche : on constate notamment une disparition graduelle de la fraction précipitable par l’acide phosphotungstique. L’absence constante de la réaction du biuret avec les produits de la digestion et d’autre part, le fait que la peptone ajoutée au suc disparaît rapidement, laissent supposer que dans le suc de levure on n’a pas affaire à un seul enzyme protéolytique, mais plutôt à différentes diastases, qui concourent ensemble à l’hydrolyse.

Les protéases de la levure, soit celles que nous avons étudiées à propos du zymogène, soit celles contenues dans l’héfanol, sont évidemment de même nature que l’endotryptase. Dans tous ces cas, on aboutit à un même travail, caractérisé par une certaine proportion de bases et d’acides aminés. Au contraire, dans l’expérience de Boullanger, citée plus haut, on se trouve manifestement en présence d’autres substances actives que celles qui constituent l’endotryptase. Les produits de digestion, en effet, ne sont pas du tout les mêmes. L’hydrolyse est très peu profonde, et, d’autre part, la très grande formation d’ammoniaque ne correspond pas à un travail d’endotryptase.

En définitive, cette étude des enzymes protéolytiques de la levure est encore loin d’être claire. Le sujet n’est pas épuisé et dans le chapitre sur l’amidase, nous aurons l’occasion d’y revenir.

Actions combinées des enzymes de la levure. — Nous avons dit plus haut qu’IwANOFF avait observé que le liquide d’autolyse de l’héfanol, c’est-à-dire de levure morte, possède une action antiprotéolytique. Büchner et Hahn ont constaté la présence de ces principes inhibiteurs dans le suc même de la levure. D’après ces savants, ces produits antifermentaires ne sont pas spécifiques. Ils agissent sur la pepsine, la trypsine,

ENDOTRYPTASE DE LA LEVURE

et sur d’autres diastases protéolytiques, qui, de ce fait, digèrent moins bien l’albumine ou la gélatine. Pour mettre en évidence l’action antiprotéolytique du suc de levure sur la digestion de la gélatine par le suc lui-même, voici comment on procède : on fait une solution à 9 % de gélatine, d’une part dans de l’eau distillée, d’autre part dans du suc de levure bouilli. On met 3 cc. de ces solutions dans des tubes à réaction et, après refroidissement et prise en masse, on ajoute dans chacun des tubes un mélange de 0.75 cc. de suc et de l cc. d’eau. On met quelques gouttes de toluol et on laisse le tout à 22°:

Action antiprotéolytique du suc de levure.

Liquides employés

Liquéfaction da la gélatine

Après 24 heures

Après 48 heures

Après 72 heures

Solution de gélatine dans l’eau.

1 cc.

Solution de gélatine dans l’infusion de levure

Sur la nature de l’antitryptase du suc, on possède quelques données intéressantes. Cette substance, en solution, se montre très résistante à l’action de la chaleur; une ébullition, même très prolongée, ne la détruit point. Une alcalinisation ou une acidification préalables sont aussi sans action. Dans les cendres du suc de levure, on ne retrouve point de substance antiprotéolytique. En outre, celle-ci est détruite par l’action de la lipase. D’après Büchner, l’anticorps de la levure, qu’on appelle antitryptase ou antiprotéase, est une matière organique appartenant à la classe des éthers phosphoriques.

Cette substance spéciale intervient dans la cellule de levure comme un régulateur de l’action des enzymes, au même titre que la réaction du milieu, qui favorise l’un ou l'autre enzyme du mélange. On doit à Büchner et à ses collaborateurs quelques notions sur le jeu combiné et le rôle réci-

TRYPSINES D’ORIGINES DIVERSES.

proque des substances actives de la cellule de levure. Dans le suc de levure, on constate la présence de substances actives de nature très variée. En premier lieu, on trouve le principe capable de transformer le sucre en alcool et GO2; c’est la zymase de Büchner, qui n’est pas, du reste, une individualité bien déterminée, mais probablement un complexe d’enzymes s’adressant à différents sucres fermentescibles. Ensuite on rencontre des ferments protéolytiques; puis de l’invertine, de la maltase, unelipase, des enzymes réducteurs, des oxydases, des catalases; enfin, des amidases. A côté de toutes ces diastases, plus ou moins bien caractérisées, on trouve encore des substances de nature très particulière; ce sont l’antiprotéase et le coenzyme.

Horden et Young ont démontré que le suc de levure, actif sur le sucre, se trouve, après passage au travers d’un filtre Martin, à la gélatine, divisé en 2 parties, devenues toutes deux inactives. La partie filtrée et la partie restant dans le filtre se montrent, isolément, incapables de faire fermenter le sucre. Mais quand on les mélange, on se trouve de nouveau en présence d’un ferment actif. Le même phénomène a pu être observé en laissant dialyser du suc de levure à travers du papier parchemin. Dans le liquide dialysé il y a une substance qui rend active la zymase non dialysable. C’est cette substance, indispensable à la zymase pour faire se manifester son activité, qui a reçu le nom de coenzyme. La fermentation alcoolique résulte donc de la coopération de deux facteurs indispensables : l’enzyme proprement dit, qui est la zymase, et la substance activante, qui est le coenzyme. Ce dernier supporte la température de 100° : il ne fournit point non plus d’autres réactions caractéristiques des diastases. Le coenzyme se retrouve dans le suc de levure bouilli, et l’on peut le préparer en soumettant ce suc à l’action d’une température de 100° ; mais on l’obtient aussi en laissant macérer la levure dans de l’eau. Il est facile de démontrer qu’on est bien en possession de coenzyme, car on peut activer un suc dialysé, c’est-à-dire la zymase restée dans le dialyseur, en lui ajoutant du suc de levure bouilli, par conséquent privé de diastase.

ENDOTRYPTASE DE LA LEVURE

L’étude du coenzyme a établi que ce corps est en réalité très peu stable. Son activité diminue sensiblement en présence de 2.5 % de C03K* à 35°, et on le détruit complètement si on le maintient seulement à 130° pendant 4 heures. Le coenzyme est indifférent à l’action des enzymes protéolytiques, mais il se détruit, au contraire, sous l’influence de la lipase, en mettant en liberté de l’acide phosphorique. Gomme on le voit, cette substance ressemble par certains côtés, en particulier par sa nature chimique, à l’antiprotéase, dont on a parlé plus haut. Mais elle en diffère par sa sensibilité aux alcalis et sa moindre résistance à la chaleur. L’antiprotéase, en effet, non seulement n’est pas capable d’activer la zymase, mais encore elle n’est pas détruite par le G03K2, ni par un chauffage de 4 heures à 130°.

Le système coenzyme + zymase, qui préside à la fermentation alcoolique, se trouve influencé par d’autres substances actives, qui proviennent aussi de la levure. Notamment, il est sensible à l’action de l’endotryptase, de la lipase et de l’antiprotéase. L’endotryptase digère et détruit la zymase. Le suc, abandonné au repos, s’altère de plus en plus, à la suite d’une action digestive de la diastase trypsique sur la zymase. Toutes les conditions qui favorisent l’activité de l’endotryptase (acidité du milieu, température de 35-37°, etc.) sont par conséquent nuisibles à la conservation de la zymase. Au contraire, les conditions défavorables à l’endotryptase deviennent excellentes pour la zymase. C’est ainsi qu’à la température de 5 à 7°, on peut conserver le suc de levure une quinzaine de jours, tandis qu’à la température de 35°, après 5 ou 6 jours, on constate déjà une diminution notable de son pouvoir fermentaire. La lipase, sans avoir une action directe sur la zymase, influence aussi le système coenzyme-zymase, parce qu’elle agit sur le coenzyme, ainsi que sur l’antiprotéase.

Dans l'inactivation du suc, au point de vue ferment alcoolique, résultant d’une autolyse plus ou moins prolongée, on peut observer deux sortes de phénomènes. Dans le premier cas, l’inactivation se produit parce que le coenzyme est altéré; dans ces conditions, l’addition de suc bouilli ramènera le suc à un

TRYPSINES D’ORIGINES DIVERSES.

meilleur pouvoir fermentaire, par l’apport du complément manquant, le coenzyme. D’ailleurs cette addition de suc bouilli contribuera grandement à la conservation du suc frais, car le coenzyme et l’antiprotéase protègent tous deux la zymase de l’action destructrice de l’endotryptase. Mais cette protection ne sera pas de longue durée. La lipase, présente dans le suc, détruira bientôt le coenzyme, ainsi que l’anticorps, et une nouvelle addition de suc bouilli sera nécessaire pour provoquer dans le suc altéré une nouvelle activité, grâce à la portion de zymase qui a pu échapper à l’action de l’endotryptase.

Tout autre est le cas qui se présente quand on abandonne le suc de levure pendant très longtemps à lui-même. Ici ce n’est pas seulement le coenzyme qui est altéré, mais bien la zymase elle-même qui est digérée ou détruite par l’endotryptase. Dans ces conditions, l’addition de coenzyme ou de suc bouilli n’amènera aucune activité nouvelle du suc. Ainsi, en se plaçant exclusivement au point de vue de la zymase, on voit comment interviennent directement les enzymes, l’endotryptase, la lipase, l’antiprotéase, dans la conservation du pouvoir fermentaire du suc de la levure. L’influence réciproque des enzymes, les modifications de la composition du milieu produites par chacune de ces substances actives, jettent une lumière toute particulière sur le rôle des diastases, sur leur jeu combiné, ainsi que sur les complications chimiques qui en résultent.

Protéases microbiennes.

Il existe toute une classe de bactéries qui transforment profondément les matières protéiques. Dans les milieux de cultures microbiennes on retrouve non seulement les produits de digestion trypsique, mais encore un grand nombre d’autres dérivés des albuminoïdes qu’on ne rencontre pas dans les hydrolyses pepsiques ou trypsiques, tels que le phénol, des acides gras volatils, y’indol, le scatol, etc. La prove-

PROTÉASES MICROBIENNES.

nance de ces produits a tout d’abord été attribuée à l’activité vitale des cellules; mais, au fur et à mesure que nos connaissances sur les enzymes se sont élargies, on a constaté que le travail de désagrégation des matières azotées se faisait à l’aide, soit d 'ectoenzymes, traversant la membrane cellulaire, soit d ’endoenzymes, exerçant leur action à l’intérieur des cellules.

Propriétés générales. — Les bactéries possèdent des diastases protéolytiques très variées. Dans le présent chapitre nous envisagerons seulement la classe des protéases microbiennes, nous réservant de revenir, dans la suite, sur d’autres enzymes protéolytiques, qui concourent aussi, et même plus activement encore, à ramener la matière albuminoïde complexe à des produits relativement simples. Le ferment putride, le B. mesentericus vulgaris, le vibrion du choléra, ainsi qu’un grand nombre d'autres bactéries, sécrètent des protéases. Geret et Hahn ont mis en évidence la présence de ces enzymes protéolytiques dans le bacille de la tuberculose, dans celui de la fièvre typhoïde, dans la Sarcina rosa. Pour déceler ces diastases, les auteurs ci-dessus ont appliqué la méthode de Büghner, relative à l'extraction du suc de levure. Le suc, obtenu par pression des cultures de ces bactéries, renferme des albumoses : quand on l’abandonne à l’autodigestion, la quantité de ces dernières diminue notablement, par suite de l’action des protéases contenues dans le liquide.

La marche de la sécrétion des protéases par les bactéries dépend surtout de la réaction du milieu, ainsi que de sa composition. Suivant le mode de nutrition, la quantité de protéase fournie par une même espèce bactérienne peut subir de grandes variations. C’est ainsi que pour les b. virides, b. anthracis et b. lupiliperda, la sécrétion dépend du mode de culture et de son âge. Le b. mesentericus , cultivé sur de grandes surfaces, produit 20 fois plus de protéase que s’il est cultivé en profondeur, quoique dans le même milieu. D’après Fermi, les protéases bactériennes agissent en réaction neutre ou faiblement alcaline. L’acidité du milieu est très nuisible, surtout

TRYPSINES D’ORIGINES DIVERSES.

si elle est réalisée à l’aide d’un acide minéral. Les protéases agissent sur la gélatine, la fibrine, mais très difficilement sur l’albumine non coagulée.

La température optima est comprise entre 30 et 40°. A la température de 4 à 5°, il n’y a plus d’action ; mais même le plus grand froid, comme — 200°, ne détruit pas les protéases. La substance active des protéases, exposée pendant un temps prolongé à l’action de la lumière, s’altère profondément. La température de destruction des protéases diffère, d’antre part, suivant leur provenance. Les protéases du v. cholérique, du b. anthracis, du vibrio Finkler-Prior, supportent assez bien les températures élevées : pour les détruire, il faut porter les diastases de 65 à 70° pendant une heure. Les diastases protéolytiques du b. ramosus, du b. prodigiosus , du staphylococcus pyocyaneus aureus, se détruisent déjà à une température inférieure à 55°. Celle du b. pyocyaneus, du b. subtilis, du b. fiuorescens, du b. mégathérium, perdent leur activité à 55-60°. Les ectoprotéases bactériennes possèdent un pouvoir dissolvant très énergique, mais la protéolyse n’est pas très profonde. Au contraire, les endoprotéases produisent généralement des hydrolyses beaucoup plus profondes. Cette particularité s’explique peut-être par ce fait que, dans ce dernier cas, il entre aussi en jeu d’autres diastases protéolytiques que les protéases proprement dites que nous envisageons ici.

Résistance à la chaleur des protéases des b. pyocyaneus et b. prodigiosus. — Karl Meyer a fourni d’intéressantes données sur les protéases du b. prodigiosus, d’une part, et du b. pyocyaneus , de l’autre. Pour obtenir ces diastases, on cultive tout d’abord ces bactéries dans des bouillons nutritifs très faiblement alcalins. Après un certain temps, les liquides sont filtrés : le b. pyocyaneus se laisse aisément filtrer sur du papier; quant au b. prodigiosus, on doit employer des bougies de porcelaine. Le maximum d’activité protéolytique est obtenu avec le b . prodigiosus après 2 ou 3 semaines; le second bacille arrive plus rapidement au maximum. Les deux liquides filtrés possèdent des pouvoirs protéolytiques

PROTÉASES MICROBIENNES.

très prononcés : ils liquéfient rapidement la gélatine avec formation d’acides aminés. Pour les cultures de b. pyocyaneus, l’addition de 4 % de glycérine au bouillon nutritif favorise considérablement la production des enzymes protéolytiques. Au contraire, pour le b. prodigiosus, cela n’est pas nécessaire. Avec ces deux protéases, l’optimum du milieu correspond à une réaction légèrement alcaline. Les enzymes travaillent moins bien en réaction neutre, et encore moins en milieu acide. Par comparaison avec la trypsine, ces deux bactéries-protéases paraissent être plus défavorablement influencées par l’alcali que la trypsine.

Des faits intéressants sont à retenir dans l’action de la chaleur sur ces deux enzymes protéolytiques. Tout d’abord on constate que la prodigiosus-protéase résiste à la température de 100°, tandis que la température de 56-60° atténue considérablement son pouvoir digestif :

Action de la. chaleur sur la prodigiosus-protéase.

Quantité de prodigiosusprotéase

Diastase

non

chauffée

Diastase chauffée 30 minutes à

Diastase chauffée à 100*

5 minutes

15 minutes

La protéase, chauffée ou non, à raison de 1 cc. à 0.05 cc., est ajoutée à un volume constant d’une solution de caséine : on laisse digérer pendant un temps donné et l’on constate ensuite l’état de la protéolyse : 1/1 indique une digestion complète, c’est-à-dire la non-formation de précipité par addition ultérieure d’acide; 1/2 indique une digestion incomplète, etO, l’absence de digestion. Sous la rubrique : Diastase non chauffée, on voit qu’avec 0.1 cc. de protéase non chauffée, on obtient encore une digestion complète. Au contraire, la protéase qui a été maintenue 30 m. à 56° avant d’être mise en contact avec la caséine,

TRYPSINES D’ORIGINES DIVERSES.

se trouve considérablement affaiblie, et même à la dose de 1 cc.* on arrive seulement à une digestion partielle. Le rapport entre le produit témoin et celui qui a été chauffé est comme 1 à 0.05. La destruction de l’enzyme à 56° est très rapide et, dans certains cas, après 5 minutes, on l’a déjà considérablement affaibli. Le liquide devenu inactif ne retrouve pas son activité si on le porte à 100°. Cependant on voit qu’on peut maintenir la protéase, chauffée d'emblée à 100°, pendant 15 m., sans qu’il y ait une diminution sensible dans son pouvoir protéolytique.

On pourrait croire que la résistance à l’ébullition résulte de la présence, dans le liquide de culture, de substances capables de protéger l’enzyme contre l’action de la chaleur. Cependant, des cultures deô.prod^iosMS,faitesdans des milieux exempts d’albuminoïdes, et contenant ainsi très peu de substances colloïdales, fournissent le même résultat. Pour expliquer cette résistance, on peut faire deux hypothèses. Tout d’abord on peut admettre que l’enzyme, par sa nature même* résiste à une température de 56°. Elle se détruirait cependant à Gette température, par suite de l’intervention, soit d’une autre diastase existant dans le liquide, soit d’une antidiastase, ces deux agents d’inactivité disparaissant à une température voisine de 100°. La seconde hypothèse est que l’antiprotéase se forme de toutes pièces dans le liquide à une température de 56°, si bien qu’en portant la solution brusquement vers 100°, on évite la formation de ce corps. D’après Béarn et Cramer, on pourrait admettre ici l’intervention de zymoïdes, sorte d’anticorps qui résultent de l’action d’une chauffe modérée sur les diastases; on sait, en effet, que dans certains cas, les solutions d’enzymes, maintenues à 56°, peuvent se transformer en engendrant des corps qui paralysent les enzymes dont ils proviennent. Mais cette seconde hypothèse ne se vérifie point. En portant une solution de prodigiosus-protéase à la température de 56®, on ne produit pas de corps capables de nuire à l’action protéolytique, car un tel liquide, chauffé à 56°, ajouté à une solution neuve de protéase, ne modifie aucunement son pouvoir digestif

PROTÉASES MICROBIENNES. 451

Voici maintenant l’action de la température sur la pyocyaneus-protéase :

Quantité de pyocyaneusprotéase

Diastase

non

cbauffée

Diastase chauffée 30 m. à

Diastase portée à 100®

5 minutes

15 minutes

On voit que la pyocyaneus-protéase résiste aussi à la température de 100°. La durée du chauffage est même sans importance. Mais cet enzyme est beaucoup moins sensible à la température de 56° que la prodigiosus-protéase. Tandis qu’avec le prodigiosus, la température de destruction est 56°, il faut atteindre ici 85° pour avoir un effet très net.

Il est d’ailleurs intéressant de remarquer que ces deux protéases, tout en résistant à la température de l’ébullition, ne fournissent que très peu de travail, dans ces conditions : à 100°, elles ne sont pas détruites, mais elles n’agissent pas sensiblement, non plus. La température optima pour les deux protéases est de 37°.

Individualité des protéases microbiennes : leurs anticorps. — Au point de vue de l’individualité des protéases bactériennes, on possède aussi quelques données curieuses. Par la préparation de lapins, au moyen d’injections répétées de doses croissantes de prodigiosus-protéase ou de pyocyaneusprotéase, on obtient des sérums contenant des antiprotéases. Ces deux anticorps sont spécifiques : ils agissent exclusivement sur les protéases correspondantes. De plus, ils sont sans action sur la trypsine. Ces antiprotéases supportent la température de 75° pendant une demi-heure sans s’affaiblir sensiblement ; à 85°, on constate un commencement d’altération, et à 100°, la destruction est complète. Un mélange de protéase et d’antiprotéase correspondante, dans les proportions voulues pour qu’il soit inactif, devient à nouveau actif quand on le porte à 100°, par suite de la destruction de l’anticorps.

TRYPSINES D’ORIGINES DIVERSES.

L’antiprotéase et l’antitrypsine contenues dans le sérum diffèrent non seulement au point de vue physiologique, mais encore au point de vue chimique. L’anti protéase se précipite presque quantitativement quand on sature le sérum à moitié de sulfate d’ammoniaque. Elle se trouve donc dans la fraction des globulines. Au contraire, l’antitrypsine du sérum se précipite dans la fraction de l’albumine. Les deux anticorps peuvent donc être séparés, soit par précipitations fractionnées, soit par le chauffage. En chauffant le sérum pendant une demi-heure à 75°, l’antitrypsine est détruite, tandis que l’antiprotéase résiste. Ajoutons que l’antiprotéase, ainsi, du reste, que l’antitrypsine, s’affaiblissent par un traitement au pétrole ; l’action cependant est trop faible pour pouvoir conclure à la nature lipoïdale de ces substances. L’action des antiprotéases sur les protéases est très rapide. On obtient les mêmes résultats si on laisse agir quelque temps le sérum antiprotéasique sur la protéase, avant de les mettre en présence de la caséine, ou si on mélange directement les trois corps ensemble. Dans l’action de l’antitrypsine sur la trypsine on observe, au contraire, le phénomène de Danysche, qui consiste dans ce fait que la quantité d’antitoxine neutralisée par une quantité donnée de toxine est plus grande par une addition de celle-ci, ménagée et progressive, que par l’addition en une seule fois. Avec l’antiprotéase, on n’observe point cette marche particulière.

Méthodes de recherche des protéases dans les cultures bactériennes. — Pour la recherche des enzymes protéolytiques microbiennes, ainsi que pour l’évaluation de leur quantité, on se sert de cultures filtrées sur bougie. Les liquides, débarrassés de bactéries, sont additionnés de 0.5 à 1 % de toluol et fortement agités. C’est dans ces solutions qu’on essaie le pouvoir protéolytique au moyen d’albumine, de fibrine, de gélatine, de peptone ou de caséine. Pour déterminer le pouvoir diastasique à l’aide de gélatine, on emploie des solutions à 7 % de cette substance, additionnées de phénol ou de thymol. On verse 3 ou 4 cc. de cette solution dans des tubes de 8 millimètres environ de diamètre, on laisse refroidir pour

PROTÉASES MICROBIENNES.

obtenir une prise complète, et l’on verse par-dessus 1 à 2 cc. de culture filtrée; on marque le niveau de la surface de séparation et l’on abandonne les tubes à la température ordinaire. L’évaluation de la quantité d’enzyme se fait d’après le volume de gélatine liquéfiée. Au lieu de solution de gélatine, on emploie aussi de la gélatine colorée avec du carmin. On découpe des lamelles de petites dimensions, qu’on abandonne dans l’eau pendant 24 heures pour les débarrasser de l’acide et des impuretés qu’elles peuvent contenir, puis on les suspend par un fil dans le liquide à analyser. L’intensité de la protéolyse se mesure ici d’après la coloration que prend la solution.

Pour faire les essais à la fibrine ou à l’albumine, on prend une certaine quantité de ces substances, on les plonge dans la culture bactérienne filtrée et thymolée, après ou sans dilution préalable. On laisse les vases à 37°, on neutralise les liquides et l’on ajoute 10 % d’une solution saturée de NaCl. On fait bouillir, on amène à volume constant, on filtre et l'on détermine l’azote dans les liquides filtrés. Pour caractériser de plus près la protéase dans les cultures bactériennes, l’emploi de peptone de Witte est à recommander. On se sert alors d’une solution à 2 % de ce produit, qu’on stérilise à 2 atmosphères pendant 30 minutes. Après refroidissement on ajoute un certain volume de culture filtrée, de 1 à 10 %, et l’on détermine dans le mélange l’azote total, l’azote tannin et l’azote formol, d’après Soerensen. Dans un second essai, préparé de la même manière, on laisse la digestion se poursuivre pendant 3 ou 4 jours à 38°. On analyse alors le liquide et l’on compare les résultats. La différence dans l’azote tannin et l’azote formol indiquera l’étendue du travail protéolytique et pourra surtout révéler la présence, dans le liquide, d’enzymes autres que les protéases proprement dites, celles-là, de la famille de l’érepsine, donnant une plus grande quantité de produits très dégradés.

Dans ces sortes d’essais, il faut cependant recourir au microscope, ou mieux, essayer les liquides de digestion par piqûre sur plaques nutritives, pour s’assurer qu’il n’y a pas eu d’infection au cours de l’analyse. La filtration sur bougie pré-

TRYPSINES D’ORIGINES DIVERSES.

sente souvent de grandes difficultés, surtout quand on n’a que très peu do liquide. Dans ce cas, on maintient la culture microbienne à étudier pendant une demi-heure à la température de 55 à 60°. Puis on fait les essais dans la solution de caséine, comme il a été indiqué dans le chapitre relatif à l’analyse de la trypsine. Etant donné que la digestion est de peu de durée, une infection est fort peu à craindre ici; mais il peut arriver aussi, comme on l’a vu à propos de la prodigiosus-protéase, que l’enzyme soit déjà détruit à cette température. Dans le cas de résultats négatifs, il faudra donc répéter les essais à 50° pour vérifier si l’on n’obtient encore aucune action.

Papaïne.

Préparation. — On sait depuis très longtemps déjà que le latex du Carica papaya L.; ou arbre à melons, contient un principe qui attendrit la viande et digère les substances albuminoïdes. Vauquelin, en 1802, étudia ce suc, mais c’est surtout Wurtz, en 1879, qui en fit connaître les propriétés curieuses, et montra qu’elles étaient dues à un ferment soluble. L’enzyme protéolytique du papayer, désigné sous les noms divers de papaïne, papayotine, papaytine, papayacine, se trouve réparti dans toutes les parties de l’arbre : dans les racines, le tronc, les feuilles, les fruits et les graines. Pour obtenir la substance active, on pratique une incision sur le tronc de l’arbre; un produit de qualité supérieure est obtenu par piqûre des fruits. Le suc qui s’écoule durcit à l’air et constitue la papaïne brute. On peut également préparer une bonne matière première en pressant les fruits avec un peu d’eau et en laissant le jus se dessécher à l’air. Dans l’un et l’autre cas, le produit est réduit en poudre fine d’aspect blanchâtre, et sert à la préparation de la papaïne commerciale. A cet effet, la poudre est dissoute dans l’eau, on filtre la liqueur obtenue et l’on traite celle-ci par 10 volumes d’alcool. Le eoagulum, redis-

PAPAÏNE.

sous dans l’eau, est de nouveau précipité par l’alcool. Le produit ainsi purifié est finalement desséché à basse température, puis pulvérisé. La papaïne de très bonne fabrication peut dissoudre en 12 heures près de 2,000 fois son poids de fibrine. Cependant, on trouve rarement des produits de pareille activité.

Produits de l’hydrolyse. — La papaïne dissout les matières albuminoïdes naturelles, ainsi que les substances protéiques vivantes, telles que les muscles, les fausses membranes diphtériques, les tissus cancéreux, etc. Par l’action digestive de la papaïne, on arrive très rapidement au terme de peptone, et cela beaucoup plus vite qu’avec la pepsine. L’hydrolyse est aussi plus profonde; on aboutit promptement au tryptophane, et dans les opérations de longue durée, à la tyrosine. Cependant la tyrosine ne se produit point dans les digestions papaïniques avec la même facilité que dans le travail de la trypsine. Quand on additionne le liquide de digestion de la fibrine, de la caséine ou de l’albumine par la papaïne, d’une macération de Russula delica, on obtient une coloration rouge passant lentement au vert, au lieu du rouge-noir. De plus, quand on abandonne de l’albumine à l’action prolongée de la papaïne, on n’observe point, au fond des vases, des cristaux de tyrosine; en somme, la question de savoir jusqu’où s’étend l’hydrolyse par le ferment du papayer est encore assez obscure. Kutscher et Lohmann ont bien constaté dans les produits formés, la leucine, l’acide aspartique, le glycocolle, l’arginine, l’bistidine, la lysine, la proline, le tryptophane, la tyrosine, etc.; mais leurs résultats, comme d’ailleurs ceux d’autres expérimentateurs qui sont arrivés aux mêmes conclusions, ont été obtenus à l’aide de digestions très prolongées, 10 mois et plus, en présence de chloroforme, et on peut se demander si réellement il n’y a pas eu contamination et intervention microbienne.

Il n’en résulte pas moins des travaux de Emmerling et de ceux de Kutscher, qu’il y a vraiment une apparition d’acides aminés dans les digestions prolongées et que, tant au point de vue du temps que de la nature des produits formés, cette

TRYPSINES D’ORIGINES DIVERSES.

marche de l’hydrolyse diffère nettement de celle de la pepsine. Le fait que la papaïne appartient plutôt à la classe de la trypsine ressort nettement de cette constatation, faite par Abderhalden, que la papaïne décompose facilement le glycyl-1tyrosine en donnant de la tyrosine, comme le fait la trypsine, tandis que la pepsine se montre inactive sur ce même polypeptide. Mendel et Blood ont su mettre en évidence la production des acides aminés sous l’influence de la papaïne, en additionnant le liquide de digestion d’acide cyanhydrique. La présence de très faibles doses d’HCy exalte, d’après eux, l’action de la papaïne sur la fibrine, l’albumine, l’édestine, etc., et l’on arrive par cet artifice, à produire de la tyrosine et des acides aminés même dans les digestions non prolongées.

Voici, d’après les expériences d’EFFRONT, quelques données sur le travail de la papaïne, comparativement dans une soit** tion de peptone et dans une émulsion d’ovalbumine coagulée. La solution de peptone de Witte à 2 % était additionnée de 0.1 % de papaïne et abandonnée 95 heures à l’étuve, en présence de chloroforme et de xylol, puis analysée. On a trouvé pour les diverses teneurs en azote de la solution, avant et après la digestion, les chiffres suivants :

Analyse de la peptone avant et après l’action

DE LA PAPAÏNE.

Différent* azotes.

Avant.

Après.

Total

Précipitable zinc

» tanin

» tungst

Titrable formol

Ammoniacal

D’autre part, l’émulsion d’albumine était obtenue en mettant 2 % d’albumine d’œuf coagulée et finement divisée en suspension dans de l’eau additionnée de HCl à raison de 5 cc. (N) pour 300 cc. liquide. Voici le résultat de l’analyse après 78 heures d’action de la diastase :

PAPAÏNE.

Analyse d’une émulsion d’albumine après la digestion

PAPAÏNIQUE.

N total 100

N précipitable par Zn 40

» tanin 50

» tungst 36.6

N titrable au formol 44.6

Ces deux tableaux nous montrent que la papaïne agit différemment sur la peptone et sur l’albumine. Dans le premier cas, il y a bien eu digestion, c’est-à-dire destruction de l’azote albumose (précipitable par le zinc) et augmentation de l’azote peptone (précipitable par le réactif tungstique), mais l’azote des acides aminés (titrable au formol) est resté peu élevé ; au contraire, dans le deuxième cas, on a poussé beaucoup plus loin la dégradation, et la quantité d’azote Soerensen s’est trouvée plus que doublée.

Un autre caractère, qui distingue la papaïne de la pepsine et la rapproche de la trypsine, est sa facile adaptation aux réactions de milieu. La papaïne agit en milieu neutre, et la présence de 0.005 °/o HCl ou de 0.1 à 0.25% de soude lui est favorable. En présence de 0.2% HCl, la papaïne n’agit plus.

Action de la température. — La papaïne, à l’état sec, peut, d’après Wurtz, supporter une température de 105° sans perdre sa propriété de dissoudre ensuite la fibrine. En solution, elle est naturellement plus sensible, mais sa résistance est encore très grande. Harlay, pour étudier l’influence des actions thermiques sur la papaïne, porte des solutions de cet enzyme, pendant 30 minutes, à différentes températures ; puis après refroidissement, il les met en présence de fibrine et laisse le tout 24 heures à l’étuve. Voici les résultats obtenus en employant 20 gr. de fibrine pour chaque essai :

Action de la température sur la papaïne.

Liquides employés Résidu de fibrine non digérée

Solution de papaïne non chauffée

— — chauffée une demi-heure à 70°