PRÉPARATION DE LA THROMBINE

obtenue se montre très active et si l’on ajoute un peu de ce liquide à un plasma, on obtient une coagulation infiniment plus rapide que dans les conditions ordinaires.

Hammarsten prépare la thrombine par une autre méthode. Du sang frais de cheval est tout d’abord centrifugé pour en séparer les globules sanguins. Puis il est additionné de 0.3 p. c. d’oxalate de potasse : le précipité d’oxalate de chaux est enlevé par centrifugation, puis filtration. Le liquide filtré est alors étendu avec deux ou trois volumes d’eau, filtré à nouveau pour éliminer les dernières traces de matières insolubles, et ensuite acidifié au moyen d’acide acétique. Un précipité se forme, qui contient la thrombine. On le recueille et on le purifie par dissolution dans l’eau légèrement alcaline et reprécipitation par l’acide acétique. Pour arriver à un produit suffisamment pur, il est nécessaire de répéter ce traitement un certain nombre de fois. Finalement le produit est redissous dans une solution diluée de chlorure de sodium : le ferment qu’on obtient ainsi est exempt de calcium.

On peut aussi extraire la thrombine de la fibrine qui se précipite pendant la coagulation. Le sang, fraîchement recueilli, est tout d’abord dilué pour empêcher une coagulation brusque. On le laisse quelque temps en repos, puis on le fouette avec un petit balai pour en déterminer la défibrination. La fibrine fraîche est alors traitée par une solution de NaCl à 0.5 %, de titre suffisant pour dissoudre la diastase, mais trop faible pour attaquer la fibrine. On obtient ainsi une solution très active de fibrin-ferment.

Enfin, Pekelharing indique la méthode suivante pour préparer une solution active de thrombine. Il prend 300 gr. de pulpe de rate de veau, qu’il traite par 600 gr. d’eau chloroformée et centrifuge le tout le lendemain. Le liquide recueilli, après filtration, est légèrement acidifié avec de l’acide acétique. On sépare à la centrifugeuse le précipité formé, on le dissout dans de l’eau faiblement alcaline et l’on précipite à nouveau par de l’acide acétique. Ce traitement est répété à plusieurs reprises : on obtient finalement une solution alcaline qui, neu-

THROMBINE.

tralisée, et après addition de CaClJ, détermine très rapidement l’apparition de fibrine concrète dans le liquide d’hydrocèle, qu’on sait être non spontanément coagulable. Cette solution active provoque aussi la coagulation du sang que, par des moyens artificiels, on a réussi à conserver liquide.

Les procédés de préparation de la thrombine que nous venons d’énumérer, sont cependant loin d’être parfaits. Le produit qu’on obtient se montre actif seulement dans certaines conditions expérimentales. La coagulation du sang, comme on le verra plus loin, est un phénomène très complexe dans lequel différents facteurs interviennent. La substance active, obtenue par l’un ou l’autre des précédents procédés, ne peut pas être considérée comme une thrombine complète, mais plutôt comme un des constituants de celle-ci. La thrombine véritable se retrouve seulement après le battage du sang extrait des vaisseaux, et c’est le sérum obtenu qui en définitive doit servir pour étudier les phénomènes de coagulation, attendu que l’isolement de la thrombine d’un tel sérum présente certaines difficultés dues à la nature même de cette diastase.

Pour obtenir un sérum actif, on peut procéder de la manière suivante : du sang de lapin retiré des veines est dilué au 1/3 avec une solution de NaCl à 20% ; le mélange obtenu contenant 5 % NaCl est centrifugé : on recueille ainsi un plasma qui est incoagulable, en raison de sa forte teneur en sel marin. Cependant, si l’on dilue celui-ci avec 4 volumes d’eau, il se prend rapidement en masse : il suffit d’en éliminer la fibrine, pour avoir un sérum clair ayant toutes les propriétés d’une solution de thrombine Pour mettre en évidence l’action du sérum ainsi préparé, on se sert d’un plasma dilué et oxalaté à raison de 2 °/00 : ce plasma, à cause de la présence de l’oxalate, ne se coagule pas spontanément, même après dilution ; il se comporte jusqu’à un certain point comme une solution de fibrinogène, et se prend en masse quand on lui ajoute de la thrombine active ou du sérum. Ainsi, par un artifice assez habile, on arrive à séparer du sang les deux facteurs qui interviennent dans la coagulation : d’un côté, on a le sérum

PRÉPARATION DU FIBRINOGÈNE.

contenant la diastase toute formée, de l’autre, on a le plasma dépourvu de thrombine active et contenant cependant le fibrinogène.

L’action de la thrombine peut néanmoins être étudiée en dehors du sang, en se servant du principe albuminoïde contenu dans le plasma, le fibrinogène, corps sur lequel la diastase agit et qu’on considère comme la substance mère de la fibrine.

Le fibrinogène se rencontre non seulement dans le sang et la lymphe, qui est du sang blanc, mais encore dans les transsudats séreux, normaux ou pathologiques, tels que les transsudats péritonéal et péricardique, le liquide d’hydrocèle, le liquide d’œdème, etc. : ces transsudats ne sont pas spontanément coagulables, mais ils contiennent cependant du fibrinogène et se coagulent, si on les additionne de fibrin-ferment.

Pour isoler le fibrinogène, on possède différentes méthodes. La première en date est due à Denis (1857). Celui-ci, en additionnant du plasma salé, d’une quantité massive de NaCl, en précipitait les matières albuminoïdes. Le coagulum, traité ensuite par de l’eau faiblement salée, abandonnait au liquide une partie de son fibrinogène. D’autre part, Schmidt a réussi à isoler le premier ce corps en partant du liquide d’hydrocèle. Pour préparer le fibrinogène, on reçoit quatre volumes de sang de cheval, sortant de la veine, dans un volume d’une solution saturée de SO‘Mg : le sang, par suite de cette addition saline, reste incoagulable. On se débarrasse des globules par centrifugation et filtration, puis on mélange le plasma obtenu avec un volume d’une solution saturée de NaCl. Dans ces conditions, le fibrinogène se précipite. On le recueille sur un filtre, on l’essore entre des doubles de papier et on le purifie par dissolution dans une solution de NaCl à 8 °/0, puis précipitation au moyen de NaCl saturé. Après plusieurs traitements successifs, le produit qu’on obtient, desséché sur du papier, se dissout facilement dans l’eau distillée, grâce à sa teneur de 2 °/00 NaCl qu’il contient encore. On peut alors débarrasser le fibrinogène de ce sel, par dialyse, en présence d’eau très faiblement alcaline.

Le fibrinogène peut encore être préparé à l’aide de plasma

THROMBINE.

oxalaté. Le sang sortant des vaisseaux est mélangé avec son volume d’une solution d’oxalate à 6 0/0o, on centrifuge et on laisse reposer pendant vingt-quatre heures à 0°. On décante le liquide clair et on l’additionne d’une solution saturée de NaCl, contenant 1 °/0 o d’oxalate, jusqu’à ce que la teneur en sel soit de 15 %. Le fibrinogène se sépare alors en coagulum; on le recueille et on le purifie comme précédemment, par dissolutions et reprécipitations successives à l’aide de NaCl. Reyé, pour séparer le fibrinogène, traite douze parties de plasma fluoré, additionné de trente parties d’eau, par seize parties d’une solution de sulfate d’ammoniaque saturé. Dans ces conditions, le fibrinogène se précipite : on le recueille et on le purifie selon le mode habituel.

Le fibrinogène précipité se présente sous la forme d’une masse poisseuse, adhérente au verre. Insoluble dans l’eau distillée bouillie, il se dissout légèrement dans l’eau non bouillie et sa solubilité augmente avec la richesse de celle-ci en oxygène. Il se dissout aussi dans une solution faible de NaCl, mais se précipite, si l’on vient à étendre d’eau la liqueur, par suite de la trop grande dilution du chlorure.

Une solution de fibrinogène dans une solution étendue de NaCl se trouble entre 52 et 53°. Le fibrinogène se coagule à 56°. D’après Bordet et Gengou, du plasma salé, fraîchement dilué à 1 %, chauffé pendant dix minutes vers 53°, se coagule encore sous l’influence de la thrombine; il ne se coagule plus si la température s’est élevée, pendant le même temps, à 54° environ; le liquide est devenu opalescent par suite de l’altération du fibrinogène. Une solution de fibrinogène, additionnée de thrombine, se comporte de la même manière que le sang au sortir des vaisseaux. Le liquide change bientôt de consistance et il se produit un coagulum plus ou moins résistant, suivant la concentration en fibrinogène.

Quant à la thrombine, elle possède les caractères d’un enzyme : elle est précipitée de ses solutions par l’alcool et est entraînée par des précipités déterminés dans le liquide; elle est très sensible à l’action de la température et aux conditions de milieu. De plus, dans son action sur le fibrinogène, on peut