Leucine

Alcool isoamylique

C6H4(OH) — CH2.CH(N H2).C02H-f-H20 = C3H-'(0H)-CH2.CH2.0H+C02-(-NH3

Tyrosine Alcool oxyphényléthylique

C6H5.CH2.CH(NH2).C02H-fH20 = CeH5.CH2.CH2.0H+C02+NH3

Phénylalanine Alcool phényléthylique

Les alcools issus des acides aminés subissent, dans certains cas, des transformations relativement profondes au moment de leur apparition. C’est ainsi que l’acide glutamique ne fournit point d’acide oxybutyrique, mais bien de l’acide succinique. Ehrlich a démontré, en effet, que l’acide succinique de la fermentation alcoolique ne provient que de l’acide glutamique et ne se forme nullement aux dépens du sucre, comme on le croyait autrefois. Sa formation est schématisée comme suit :

C02H.CH(NII2).CH2.CH2.C02H-f-H20 = CH20H.CH2.CH2.C02H+C02+NH3 Acide glutamique Acide oxybutyrique

Ce dernier par oxydation donne de l’acide succinique : CH20H.CH2.CH2.C02H4-02 = C02H.CH2.CH2.C02H+H20

Acide oxybutyrique Acide succinique

D’après Ehrlich, il se formerait comme corps intermédiaire de l’acide oxyglutarique C0sH.CH0H.(CH2)2.C02H. Mais, étant donné la facilité avec laquelle doit s’éliminer le groupe car-

AMIDASES.

boxyle de l’acide glutamique, cette explication n’est guère plausible; du reste, la présence de ce corps n’a pas été constatée dans les produits de la fermentation alcoolique.

L’ammoniaque formée dans la réaction étudiée par Ehrlich, en présence de levure, ne se trouve point à l’état libre comme celle provenant des autres amidases précédemment étudiées. L’absence d’ammoniaque libre dans le cas présent rappelle beaucoup les conditions de la germination. Dans les grains germés on trouve également très peu de ce corps, alors que la germination produit une désamidation très intense. Dans ces deux cas, il y a eu cependant formation réelle et intense d’ammoniaque, mais cette dernière a servi à la cellule vivante pour un travail synthétique.

Au début de ses recherches sur les levures, Ehrlich expliquait les transformations observées, par l’activité vitale, et se refusait à admettre toute intervention diastasique. A la suite des travaux parus sur ce sujet, il modifia sa manière de voir et prétendit alors que la diastase des levures formant les alcools supérieurs est un enzyme intracellulaire, incapable d’entrer en solution et n’agissant, par suite, que dans les cellules vivantes. Cette conception est cependant tout à fait erronée.

La levure de bière délayée dans de l’alcool faible ou dans des solutions étendues de NaFl conserve sa vitalité pendant très longtemps. Sans doute, dans ces liquides débarrassés de cellules, et contenant parfois plus de 90% de l’azote total de la levure, on trouve bien de l’ammoniaque et des alcools supérieurs (amylique et butylique) : dans le filtrat provenant d'une levure autophagiée depuis six mois, on a constaté, par exemple, sur 100 d’azote total, 42 à l’état ammoniacal; on a démontré, en outre, que cette ammoniaque était combinée aux acides volatils (surtout à l’acide butyrique), donc à l’état de sels. Mais, d’autre part, la solution provenant d’autophagie de levure en présence de fluorure de sodium agit aussi sur la leucine et l’asparagine en formant de l’ammoniaque, des acides volatils et des alcools supérieurs. Or, cette action est obtenue avec le liquide parfaitement filtré, par suite exempt de toute cellule de levure. La

ÜRÉASE.

diastase donnant des alcools supérieurs peut donc, dans certaines conditions, entrer en solution tout comme les autres amidases. Du reste, la levure de bière n’est pas le seul microorganisme produisant de l’alcool amylique. Nawiasky a constaté notamment que le B. Proteus vulg. fait fermenter la leucine en donnant des acides caproïque et valérianique et de l’alcool amylique. Cet auteur a aussi établi que les bactéries mortes agissent comme les cellules vivantes, et que l’action est proportionnelle au poids du ferment.

En résumé, des différents essais faits sur la levure, on peut conclure que les cellules contiennent deux classes différentes d’amidases, les unes donnant des alcools, les autres, des acides volatils, ces deux groupes étant capables, suivant les conditions, de réagir sur les mêmes corps aminés. Pour finir, il convient encore de rappeler cette propriété curieuse, signalée par Chodat. D’après cet auteur, les diastases oxydantes, telle que la tyrosinase, peuvent agir comme des amidases. La mise en liberté de l’ammoniaque marche alors parallèlement à la formation de corps appartenant au groupe des aldéhydes. C’est ainsi que le glycocolle se transformera, en présence de tyrosinase, d’après l’équation suivante :

NH2 — CH2 — C02H + O = CO2 -(- NH3 + H.COH.

Glycocolle Aldéhyde formique

Des réactions du même ordre s’observent avec l’alanine, le phényglycocolle, etc. Bien que la formation d’aldéhyde, et la libération d’ammoniaque qui en résulte, soient très peu prononcées et demandent à être confirmées, cette décomposition est néanmoins intéressante, car, toute différente de celles étudiées jusqu’ici, elle nous suggère une interprétation possible du mode d’action des amidases, manière de voir qui mériterait d’être soumise au contrôle de l’expérience.

Uréase.

Les transformations que subit l’urine abandonnée à ellemême ont depuis longtemps attiré l'attention des savants.

AM1DASES.

Vauquelin et Dumas, les premiers, ont reconnu que le changement de réaction que l’on constate dans l’urine exposée à l’air correspond à une transformation d’urée en carbonate d’ammoniaque :

GO (NH2)2 + 2 H20 == CO3 (N H*)2

Urée Carbonate d’ammoniaque

On a alors assimilé ce phénomène à une fermentation, dont l’origine était attribuée aux substances organiques formant le dépôt de l’urine altérée. Cette théorie a été soutenue surtout par Jacquemart. Ce n’est qu’en 1860 que Müller cherche à expliquer la formation de l’ammoniaque dans l’urine, par l’intervention des microorganismes ; mais il n’apporte pas de preuve décisive pour appuyer cette nouvelle manière de voir. Cependant, à la même époque, Pasteur isole la Torula urece, que Van Tieghem décrit ensuite sous le nom de Micrococcus ureœ. Les données fournies par Pasteur et Van Tieghem furent confirmées plustardpar la découverte de nombreux microorganismes, capables de transformer l’urée. Ce sont, entre autres : YUrococcus, Y Urosarcina. la Planosarcina, le Micrococcus ureœ liquefaciens, divers urobacilles, etc. On doit notamment à Miquel la caractérisation de plusieurs de ces espèces microbiennes spéciales.

Les ferments de l’urée sont très répandus dans la nature ; on les trouve dans l’air, dans le fumier, dans les eaux d’égout et surtout dans la boue des villes. Pour cultiver ces ferments, on emploie une solution de peptone additionnée de 0.2 à 0.3 gr. % d’urée. D’après Machida, l’addition de sulfate de magnésie au milieu de culture favorise grandement le développement des microbes. La fermentation de l’urée se produit surtout bien à la température de 30° ; à 5° il ne se forme presque plus d’ammoniaque ; à ô0°-70°, les cellules d’ Urococcus succombent ; toutefois les bactéries à spores peuvent être maintenues jusqu’à 80°.

Le catalyseur intervenant dans la décomposition de l’urée a été découvert en 1874 par Musculus. Ce savant, en effet, a constaté que l’urine ammoniacale, filtrée et évaporée dans le vide, est capable, si on l’ajoute à de l’urée fraîche, d’en pro-

URÉASE.

voquer la fermentation ; on obtient, du reste, un résultat analogue avec le produit obtenu en précipitant par l’alcool l’urine décomposée, épaisse et filante. Musculus établit ainsi que la production d’ammoniaque n’est pas due exclusivement au ferment figuré, et il admet qu’elle résulte de l’action d’une substance spéciale, de nature diastasique, dont le siège de sécrétion se trouverait, d’après lui, dans la vessie. On le voit, tout en constatant la présence de l’enzyme, Musculus n’a pas saisi la relation qui existe entre le ferment figuré et la substance active qu’il venait de retirer. C’est Miquel qui a démontré définitivement que*la diastase agissant sur l’urée est bien sécrétée par un microorganisme. Ce catalyseur spécial a été décrit d’abord sous le nom d 'urase, puis sous celui d ’uréase.

Pour isoler l’uréase, on fait fermenter une solution de peptone additionnée de 2 à 3 gr. par litre d’urée, avec une culture pure d’uro-bactéries ; la culture maintenue à 30° se trouble fortement. Après 3 ou 4 jours, on filtre à travers une cloison poreuse ; le liquide clair, débarrassé des bactéries, peut servir comme solution d’uréase. C’est une liqueur très active : un litre peut transformer par heure jusqu’à 120 gr. d’urée. A l’abri de l'air, ces solutions d’uréase peuvent se conserver pendant des mois. Si on les additionne de deux volumes d’alcool, elles donnent un précipité qui, lavé à l’alcool à 50°, devient de moins en moins soluble, tout en gardant une certaine activité. Toutefois on perd, par ce traitement à l’alcool, environ la moitié de la substance active. On peut aussi recueillir la diastase en provoquant dans le liquide un précipité avec des sels de chaux ; on entraîne ainsi la presque totalité de l’enzyme ; mais il est très difficile, ensuite, de débarrasser l’uréase recueillie, des sels de chaux qui restent adhérents.

Kossowicz a constaté la présence d’uréase dans les moisissures: ainsi, Y Aspergillus niger, Y Aspergillus glaucus, le Penecillium crustaceum, le Mucor Boidin, et bien d’autres, détruisent l’urée, avec formation d’ammoniaque; Shibata a retrouvé cet enzyme dans les champignons ; enfin, Emmerling et Reiser ont reconnu queleB./luorescens ligue faciens e stcapa-

AMIDASES.

ble aussi de transformer l’urée en carbonate d’ammoniaque.

D’après Takeuchi, l’uréase se trouve également dans le règne végétal : les fèves de soja ( Glycin-hispida ) germées contiennent un enzyme qui agit sur l’urée de la même façon que l’uréase microbienne. La substance active peut être extraite par une macération dans l’eau; 1 gr. de soja transforme ainsi, en 20 h., l’urée renfermée dans un litre d’urine. L’uréase de soja agit exclusivement sur l’urée; elle est inactive sur d’autres combinaisons aminées et amidées. Au contraire, d’après quelques auteurs, l’uréase microbienne, contenue dans certains bouillons de culture, agirait aussi sur l’asparagine. Toutefois, ce fait ne se retrouve pas avec l’uréase extraite par précipitation de ces liquides, et l’action observée sur les acides aminés doit vraisemblablement être attribuée à l’intervention d’autres amidases accompagnant l’uréase.

Influence des conditions physiques et chimiques. — La température optima pour le travail de l'uréase est comprise entre 48 et 50°. Mais il y a lieu de remarquer que cet enzyme est très sensible à l’influence thermique ; c’est ainsi que la température optima est en même temps une température de destruction :

Variations de la force de l’uréase avec la température.

Durée de l’action.

2 1/2 heures.

Température.

Teneur en uréase.

Une solution d’uréase, maintenue pendant 2 h. 1/2 à 14°, conserve encore entièrement son titre primitif, qui est exprimé ici par le chiffre 100; à la température de 41°5, la teneur en uréase est de 91.36; à 56°, elle n’est plus que de 46 ; enfin, lorsqu’on arrive à 65°, la destruction devient très rapide. Voici, d’autre part, les pertes d’activité d’une solution d’uréase conservée pendant 10 minutes à différentes températures :

Après 10 m. à 64°, le titre en uréase tombe de 100 à 97.8 » 66° » » 36.7

URÉASE.

L’uréase supporte une alcalinité relativement forte : 0.5 °/0 de carbonate d’ammoniaque ne paralyse pas son action ; cependant 4 gr. de soude par litre de solution deviennent nuisibles. Cet enzyme est beaucoup plus sensible à la réaction acide: c’est ainsi que, en présence de 1 gr. d’acide minéral pour 5 litres de liquide, l’uréase est paralysée. Le degré de sensibilité de l’uréase à la réaction du milieu nous est indiqué par l’expérience suivante : une solution de cet enzyme est additionnée d’acide chlorhydrique à raison de 4 %; on attend 10 minutes, puis on neutralise : or, ce traitement a suffi pour détruire complètement la substance active.

La glycérine et le sucre activent le pouvoir de l’uréase. Pour mettre en évidence l’action de ce dernier corps, Miquel procède de la façon suivante : dans une expérience témoin, il ajoute à une solution active 8 °/0 d’urée; puis, dans l’essai véritable, la solution active est diluée au 1/4 avec un sirop contenant 20 % de sucre, et l’on additionne ce mélange de la même quantité d’urée que l’essai témoin. On laisse agir à la température de 48-50°, et l’on détermine dans les deux échantillons la quantité d’urée restante au bout de temps variable :

Action du sucre sur l’uréase.

Durée de l’action en heures.

Expérience sans sucre Urée disparue °/o liquide.

Expérience avec sucre Urée disparue °/o liquide.

Ainsi, après 24 heures, il y a 5 gr. d’urée détruits en présence du sucre, tandis qu’on ne compte, dans l’essai témoin, la disparition que de 1.92 gr. Le sucre agit donc comme protecteur de la diastase contre l’action de la température, phénomène qu’EFFRONT a d’ailleurs observé déjà avec beaucoup d’autres substances à l’égard des différents enzymes.

Voici maintenant, rapportée dans le tableau suivant, l’action du chlorure de sodium et de quelques autres produits sur l’uréase :

AMIDASES.

Action de diverses substances sur l’uréase.

Substances employées.

Quantité °/oo de liquide.

Valeur diastasique.

Chlorure de sodium