III.-Deutéro
Lim. inf.
albumose B IV.- Deutéro albumose C
Lim. sup.
Lim. inf.
Lim. sup.
Satur
ation en
réaction
acide.
qu’on observe des écarts allant de 2,6 à 4,2. Ce résultat peut s’expliquer, soit par une différence dans la nature de la même fraction provenant de diverses substances, soit plus simplement par l’état de pureté plus ou moins grand des matières albuminoïdes employées.
En réalité, les limites des fractions sont sujettes à certaines fluctuations provenant des conditions du milieu : la concentration et l’acidité sont des facteurs très importants de cette variation. Le rôle exercé par la concentration des matières protéiques sur les limites des fractions est très considérable. C’est ainsi que :
Limite Limite inférieure, supérieure.
Dans une solution de 5 % de peptone Witte, les limites
de la première fraction sont 2.6 4.4
Dans une solution de 10 °/0 de peptone Witte, les limites
de la première fraction sont 2.2 4.4
Dans une solution de 15 °/0 de peptone Witte, les limites
de la première fraction sont 2.2 4.8
Dans une solution de 20 °/0 de peptone Witte, les limites
de la première fraction sont 2 4.6
La limite inférieure se trouve abaissée par la concentration. Dans une solution de 5 % la limite inférieure est de 2.6, tandis que déjà dans la solution de 10 % elle descend à 2.2. Toutes les matières albuminoïdes ne se comportent pas de
PEPSINE
la même manière; c’est ainsi que Kauder a trouvé que, dans le sérum sanguin, les limites de précipitation de la globuline varient légèrement avec la quantité d’albuminoïdecontenue dans le sérum, tandis que les limites de précipitation de l’albumine du sérum sont constantes. La réaclion chimique du milieu exerce une action plus sensible encore. Voici les limites des trois fractions de fibrine peptonisée, obtenues avec une réaction neutre, une réaction alcaline et une réaction acide.
Première fraction
Deuxième fraction
Troisième fraction
Neutre
Acide
Al cal.
Neutre
Acide
Alcal.
Neutre
Acide
Alcal.
Limite inférieure
Limite supérieure
La réaction acide abaisse considérablement la limite inférieure des trois fractions. Elle exerce aussi une influence sur la limite supérieure, mais à un degré moindre. La réaction alcaline manifeste, sur ces limites de précipitation, une action moins prononcée que la réaction acide. En dehors de l’action produite par la réaction du milieu et par la concentration, les limites peuvent encore être influencées par la présence de corps étrangers dans la solution. Néanmoins, les limites de fractionnement apparaissent toujours très nettement quand on opère avec des substances relativement pures en solutions neutres et à une concentration comprise entre 2 et 5 °/0.
Les résultats obtenus par la méthode de précipitation fractionnée, à l’aide du sulfate d’ammonium, ont reçu une confirmation nouvelle par les travaux de Zunz et de Pincktus. Ces savants ont démontré que les cinq fractions, obtenues à l’aide du sulfate d’ammonium, peuvent s’obtenir également en opérant avec le sulfate ou l’acétate de zinc, ou encore avec le sulfate de sodium. Zunz, qui a étudié avec beaucoup de soin l’action du sulfate de zinc, constate une analogie absolue entre les résultats obtenus avec le sulfate de zinc et celui d’ammonium. En travaillant avec le sulfate de zinc, les trois premières fractions s’obtiennent dans la solution
ÉTUDE DES ALBUMOSES.
neutre; la quatrième, en présence d’une réaction acide et après la saturation. L’influence exercée sur les fractionnements par les conditions de milieu et le degré de concentration a été parallèlement constatée avec les deux sels. Toutefois, étant donné la formation, dans certains cas, de combinaisons de zinc insolubles, il est toujours préférable de choisir les réactions acides. La dose la plus favorable est de 0.75 d’acide sulfurique %. Pour conserver toujours les mêmes conditions de milieu, il est nécessaire d’amener au même degré d’acidité : la solution de matières albuminoïdes, celle des sels de zinc et l’eau qui sert à compléter le liquide pour en faire un volume constant. Les résultats sont alors très satisfaisants.
Les expériences de Zunz portent sur les produits de transformation de l’ovalbumine, de la sérum-albumine, de la sérum globuline, ainsi que de la caséine ; les trois premiers de ces produits étaient dans un état de pureté presque parfait. Voici comment on opère : on dissout 2 grammes de substances albuminoïdes dans 100 centimètres cubes de liquide contenant 30 centigrammes d’acide chlorhydrique et 4 centigrammes de pepsine. On laisse digérer à 40°, jusqu’à ce qu’on constate une réaction de peptone. Arrivé à ce point, le liquide est filtré, exactement neutralisé et filtré à nouveau, puis acidifié avec l’acide sulfurique jusqu’à une teneur de 0.75 % du liquide. La solution saline est préparée par saturation à froid ; elle accuse une densité de 1.450. Voici les résultats obtenus :
Limites de précipitations avec S04Zn des 4 albumoses d’après leur provenance.
Diverses fractions
Caséine
Ovalbum.
Sérum
album.
Sérum
globul.
Peptone
Wltte
Album.
i Lim. inf . .
prim.
) » sup. .
Deutéro
i Lim. inf . .
alb. A
) » sup. .
Deutéro
( Lim. inf . .
alb. B
| » sup. .
Deutéro
j Lim. inf . .
alb. C.
| » sup. .
saturation
PEPSINE
Si l’on compare les limites des fractions, obtenues d’une part avec le sel d’ammonium et de l’autre avec celui de zinc, on constate des différences assez notables ; mais on obtient dans les deux cas, un même nombre de fractions, avec un intervalle bien tranché entre les limites.
Réactions chimiques des quatre fractions d’albumose. — Les quatre fractions obtenues par la précipitation fractionnée possèdent, nous venons de le voir, des limites constantes dans les mêmes conditions de milieu et avec une même concentration. Hofmeister et ses élèves considèrent ces fractions comme étant composées de substances différentes, et ils se sont appliqués à les caractériser par des réactions chimiques. La première fraction : albumose primaire, est composée de proto-albumose et d’hétéro-albumose de Kuhne. Ces deux substances peuvent être séparées par dialyse ou à l’aide de l’alcool. Pour cela, on additionne d’un volume d’alcool à 95 %, une solution d’albumose primaire à 5 °/0 ; on chauffe au réfrigérant pendant 5 à 10 heures. La partie précipitée est l’hétéro-albumose; la substance albuminoïde restant en solution est le proto-albumose. Les deux albumoses de la première fraction diffèrent l’un de l’autre non seulement par leur solubilité dans l’alcool, mais aussi par d’autres caractères propres à l’hétéro-albumose : sa solution se trouble par quelques gouttes d’acide nitrique dilué ; elle fournit un précipité abondant en présence d’une faible dose d’acétate de cuivre, ainsi qu’avec le réactif d’ALMEN (solution alcoolique de tanin additionnée d’acide acétique) ; le précipité obtenu avec ce dernier réactif ne se dissout plus dans un excès de produit.
Les fractions 2, 3, 4 sont composées de deutéro-albumoses A, B, C. Les deux dernières sont considérées comme formées d’une unique substance. La fraction A, au contraire, est composée de deux substances a et b, qui se distinguent par une teneur différente en soufre. La fraction Aa fournit, par l’ébullition avec l’alcali et l’acétate de plomb, un léger brunissement, tandis que, traitée de la même façon, Ab donne une coloration brun noir. Il y a une différence aussi quand on
ÉTUDE DES ALBUMOSES.
ajoute aux solutions des deux substances une faible quantité d’acétate de cuivre : Aa fournit un précipité abondant, Ab ne précipite pas.
Les réactions principales des différentes fractions se trouvent réunies dans le tableau suivant :
Réactifs
lre fraction
2me fraction
3me fraction
fine fraction
Hétéro-
albumose
Proto-
albumose
Deutéro-
albumose
Aa
Deutéro-
albumose
Ab
Deutéro-
albumose
Deutéro-
albumose
Réactifs n° 1 : Solution diluée de sulfate de cuivre. — 2 : Acide nitrique à froid. — 3 : Solution à 1/2 saturée de chlorure de sodium -f- acide nitrique. — 4 : Un volume de solution saturée de chlorure de sodium acidifié par l'acide acétique. — 5 : Saturation avec le chlorure de sodium et acidifié avec l’acide nitrique. — 6 : Solution neutre, chlorure de sodium à saturation. — 7 : Ebullition du liquide avec acétate de plomb dans un milieu alcalin. — 8 : Réaction Molische.
Le signe + indique une apparition de trouble ou de précipité. Le nombre de ces signes donne une idée de l’inten3lté de l’action. Le signe — indique l’absence de trouble ou de précipité.
L’ébullition du liquide avec l’acétate de plomb, dans un milieu alcalin (réactif n° 7), est employée pour indiquer la présence du soufre oxydable. Une -f- correspond à un faible brunissement du liquide; trois -f- indiquent un noircissement et un précipité. Le deutéro-albumose Ab contiendra, d’après ces réactions, le maximum de soufre oxydable, tandis que le deutéro-albumose C est exempt complètement de soufre. La réaction de Molische (coloration obtenue par le napbtol en présence d’acide sulfurique) indique la présence d’un groupement d’hydrates de carbone. La première fraction contient peu de substances riches en hydrates de carbone, les suivantes
PEPSINE
seront beaucoup plus riches. La rubrique : Acide nitrique à froid, indique l’addition d’une ou deux gouttes d’acide nitrique dilué. L’hétéro-albumose fournit, dans ces conditions, un précipité; le deutéro-albumose Aa, un léger trouble.
Hofmeister et ses élèves attribuent une grande valeur à ces réactifs distinctifs. D’après eux, les fractions obtenues se trouvent bien caractérisées par l’ensemble de leurs propriétés physiques, chimiques et physiologiques. On doit constater toutefois que les preuves qu’ils apportent à l’appui de leur manière de voir sont loin d’être très démonstratives. Les réactions enregistrées dans le tableau, pour chacun des groupes, ne sont pas très nettes. A l’exception peut-être de l’hétéro-albumose, toutes les fractions se confondent, et, de plus, leurs réactions ne sont pas toujours constantes. Les propriétés diffèrent sensiblement, suivant les matières albuminoïdes employées. C’est ainsi que le deutéro-albumose C ne fournit point la réaction du soufre lorsqu’il provient de la fibrine, et est riche, au contraire, en cet élément, quand il provient du sérum-albumine. Les mêmes fractions donneront une réaction du furfurol faible ou forte, suivant qu’elles proviennent du produit de l’hydratation de la fibrine ou de l’ovalbumine.
Du reste, les partisans de la méthode de précipitation fractionnée reconnaissent cette irrégularité, mais ils l’expliquent ingénieusement par les natures diverses des matières premières : la fraction emprunte aux substances dont elle provient, des particularités caractéristiques. Quoi qu’il en soit, la différenciation chimique des fractions se trouve basée sur des colorations ou des précipitations. Ces réactions peuvent, en certains cas, fournir de précieux renseignements : il serait pourtant imprudent de se baser exclusivement sur ces indications pour tirer une conclusion sur l’identité de deux corps. Cette réserve s’impose tout particulièrement dans le cas présent. On n’a pas encore obtenu les matières albuminoïdes dans un état de pureté parfaite. En précipitant leurs solutions, on entraîne aussi les diverses substances qui s’y trouvent mélangées. La précipita-
ÉTUDE DES ALBUMOSES.
tion de ces substances peut se produire aussi avec intervalles, suivant la concentration du liquide ; on ne peut donc pas, même si elles se montrent constantes, se servir de certaines propriétés des fractions comme indices de différenciation. De même, les réactions de précipitations et de colorations distinctes peuvent être attribuées aussi bien aux impuretés précipitées par la présence de sels, qu’à la substance albuminoïde ellemême.
Objections faites à la méthode de la précipitation fractionnée. — Nos connaissances sur les propriétés chimiques des quatre albumoses, qu’on obtient par la méthode de précipitation fractionnée, sont encore fort peu étendues à l’heure actuelle. Les réactions des fractions, que nous venons d’étudier, apportent peu de clarté sur leur nature et surtout sur leur différenciation. Doit-on en conclure que les quatre fractions se trouvent formées de la même substance, qu’il n’y a pas de différence chimique entre les différents albumoses, et que, par conséquent, la séparation obtenue est plutôt artificielle que réelle ? Quelques savants sont de cet avis et se prononcent catégoriquement contre tous les résultats obtenus par cette méthode. D’après eux, la méthode est absolument sans valeur; les fractions qu’on obtient ne sont que des espèces chimiques créées par la manipulation, et, pour confirmer cette manière de voir, ils citent des expériences très intéressantes de Duclaux sur la cristallisation du sulfate de quinine, et montrent ainsi l’analogie existant entre la précipitation fractionnée de ce dernier corps et celle de l’albuminoïde.
La solution saturée de sulfate basique de quinine précipite en présence de sulfates de métaux alcalins ou alcalino-terreux. La précipitation, ou plutôt la cristallisation, marche à une allure très irrégulière. En choisissant une dose de sulfate d’ammonium convenable, on peut arriver à précipiter une partie de la quinine; la solution débarrassée du précipité (de cristaux) fournira de nouveau un précipité avec une nouvelle dose de sulfate d’ammonium. Voici quelques détails sur ces expériences : Dans un flacon contenant 100 centimètres cubes
PEPSINE
d’une solution de sulfate de quinine, on ajoute différentes doses de sel d’ammonium en poudre ; on laisse reposer 24 heures et on pèse le précipité obtenu.
de sulfate ammon. donne un précipité de 0.59 suif.
quinine
\ Solution de
’ sel de
> quinine :
i 2 grammes
J par litre.
1 Solution de f sel de
> quinine :
1 gr. 96
j par litre.
Entre les doses 0.1 °/0 et 0.25 °/0 de sulfate d’ammonium, on constate une très sensible différence dans la cristallisation du sulfate de quinine; on n’obtient plus ce même effet en augmentant la dose de sulfate d’ammonium : par la dose de 1 à 2 grammes de sulfate, la quantité de précipité est presque la même, quoiqu’une grande partie de quinine reste encore en solution, qui ne précipitera qu’en présence d’une beaucoup plus forte dose de sulfate d’ammonium. Cet essai nous montre la possibilité d’obtenir dans une solution de quinine un grand nombre de fractions correspondant à différentes doses de sulfate d’ammonium.
On voit aussi que la précipitation de la quinine peut se faire par coups successifs, avec des intervalles dans lesquels l’addition d’une faible dose de sulfate ne produit point de précipité. En réalité, si l’on ajoute 1 % de sel ammoniacal à une solution saturée de quinine, on obtiendra, avec le temps, un liquide qui, débarrassé du précipité, contient encore 0 gr. 8 de sel de quinine. Pour obtenir, dans ce liquide, un nouveau précipité appréciable, c’est-à-dire une deuxième fraction, il faut employer une dose de sulfate d’ammonium deux ou trois fois plus grande que celle du début. Entre la première et la deuxième fraction il y a donc une marge au moins de 1 à 3. En adoptant cette technique, on peut obtenir, à volonté, un grand nombre de fractions bien caractérisées, au point de vue
ÉTUDE DES ALBUMOSES.
des limites, mais composées toutes d’une substance identique. En présence de ces faits, les adversaires de la méthode conseillent, avec raison, une grande réserve. Ils disent qu’il faut être beaucoup plus prudent qu’on ne l’a été jusqu’ici, pour identifier les précipités produits par l’action des sels.
D’après cette manière de voir, l’action mise en œuvre dans la précipitation étant d’ordre plus physique que chimique, il est illogique de lui demander une différenciation des espèces. Toutes ces actions sont contingentes, irrégulières, ayant des caprices apparents. On ne doit pas distinguer les matières précipitées dans le même liquide par des quantités de sels inégales, ni donner le même nom aux matières précipitées dans deux liquides différents par des quantités égales de sels.
Les expériences avec le sulfate de quinine ne sont pas toutefois de nature à résoudre le problème, et l’on ne peut pas davantage admettre toutes les conclusions qu’on tire de ces résultats. Il existe évidemment une grande analogie entre les deux phénomènes, mais cette analogie n’est pas absolue. En les étudiant de plus près, on peut y relever des différences très marquantes et d’une nature essentielle : recueillons les fractions, obtenues dans les solutions de quinine, par l’addition de 1 % de sulfate d’ammonium. Dissolvons-les dans l’eau et faisons une solution saturée. Ajoutons à cette solution saturée 1 % de sel ammoniacal. Nous obtiendrons un nouveau précipité, qui ne sera pas composé de la totalité de la quinine se trouvant en solution. Pour aboutir à un précipité plus complet, il faut ajouter une quantité de sel beaucoup plus grande. En ménageant la dose de sulfate d’ammonium, nous pouvons, par coups successifs, obtenir toute une série de fractions, comme on les obtient avec du sulfate de quinine non précipité. Les fractions de quinine se comportent donc comme la quinine avant le fractionnement.
Nous constatons tout autre chose avec les matières albuminoïdes. Prenons, par exemple, une solution contenant 1 °/0 de globuline et 1 °/0 d’albumine. La méthode de précipitation fractionnée nous donnera deux fractions : le liquide
PEPSINE
saturé à moitié avec le sulfate fournira le précipité de globuline; dans le liquide débarrassé du précipité et additionné de sel jusqu’à complète saturation, on produira le précipité d’albumine. Les deux fractions purifiées fourniront des solutions se comportant tout à fait autrement que le mélange primitif. Dans la solution de globuline, un précipité apparaîtra avant que le liquide soit à moitié saturé ; la solution d’albumine ne précipitera pas, dans ces conditions. On peut obtenir les mêmes résultats avec les matières albuminoïdes peptonisées.
Par la méthode de précipitation fractionnée, les albumoses peuvent être partagés en quatre fractions, et chacune de ces fractions, prise isolément et placée dans des conditions identiques, se précipitera, en présence d’une quantité déterminée de sel, différente pour chaque fraction. Chacune des fractions isolées possède ses deux limites de précipitation, constantes et stables, pour la même concentration et la même réaction du milieu. Ce sont ces particularités qui caractérisent les fractions des matières albuminoïdes, particularités qu’on ne retrouve pas dans les fractions opérées dans une solution de sulfate de quinine.
Formation respective des différents albumoses. —
De ce que nous venons de voir, on peut conclure que l’argument principal mis en avant pour combattre la méthode des précipitations fractionnées, parle plutôt en faveur de cette méthode que contre elle. Les matières albuminoïdes, quoi qu’on dise, peuvent, dans certaines conditions, être caractérisées et séparées par des doses différentes d’un même sel.
La question de l’individualité des quatre albumoses paraît moins claire. Les réactions distinctives de ces fractions sont loin d’être nettes et concluantes; et le fait de la présence de limites constantes et différentes pour chaque fraction, tout en étant un indice favorable, ne peut servir comme base d’appréciation à l’identification chimique des différentes fractions. Le problème à résoudre est fort délicat ; on a très peu de données sur la constituation moléculaire des matières albuminoïdes et les différences qui peuvent exister entre les albumoses sont,
ETUDE DES ALBUMOSES.
par conséquent, très difficiles à saisir. Ces corps, très voisins, diffèrent peut-être par leur seul poids moléculaire, et il n’y a rien d’étonnant, dans ces conditions, qu’on ne parvienne pas à les différencier par les réactifs chimiques.
Dans l’étude des produits de saccharification de l’amidon, on se heurte à des difficultés analogues. Les dextrines que l’on obtient ne diffèrent ni par leur pouvoir rotatoire, ni par leur pouvoir réducteur. Elles se comportent d’une façon identique avec la plupart des réactifs chimiques. La différenciation des dextrines a pu être établie seulement en étudiant la marche graduelle de la saccharification, ainsi que l’action de l’amylase sur les différentes fractions de dextrine isolées.
Dans l’étude de Zunz sur l’emploi du sulfate de zinc pour la séparation des albuminoïdes, on trouve des indications intéressantes, sur la répartition de l’albumose, aux différentes phases de la peptonisation des matières albuminoïdes. Zunz se sert, pour ses recherches, de solutions à 3 grammes par litre de pepsine dans l’acide chlorhydrique. Dans la solution active, il dissout une certaine quantité de substance albuminoïde : de 1 à 1 V2 %. Il laisse digérer à 40° et il prélève des échantillons à différents intervalles. Dans ces échantillons, il précipite quatre fractions à l’aide du sulfate de zinc. Il détermine l’azote total du liquide avant la précipitation par le sulfate, puis l’azote contenu dans chaque fraction précipitée. Cette analyse d’azote sert do base à la répartition des différents albumoses et peptones. Voici les chiffres obtenus avec le sérum-albumine cristallisé :
(Voir tableau comparatif, page 238.)
Le premier prélèvement d’échantillon estfaitaprès 2 heures. A ce moment, le liquide ne fournit plus de précipité d’acide albumine par la neutralisation.' La rubrique « albumose total » (6e colonne) nous indique alors que, sur 100 azote contenus dans le liquide, 36.5 se trouvent dans l’albumose. L’albumose total diminue au fur et à mesure que la peptonisation avance ; après 8 heures, on a 23,91 ; après 72 heures, il ne reste que 6.81. On remarque une chute analogue dans la rubrique « albumose
PEPSINE
Répartition des différents albumoses au cours
DE LA PEPTONISATION.
Durée
de
l’action
Heures
Répartition d’azote dans les fractions : Azote
Album.
prim.
Deutéro alb. A
Deutéro alb. B
Deutéro alb. C
Album.
total
Deut. alb.
total
primaire ». Après 2 heures, 17,94 ; après 4 heures, 7.02; après 48 heures, 0.7. La marche décroissante de l’albumose primaire est très rapide, et la quantité disparue est supérieure, à certain moment, à la quantité d’albumose total transformée. C’est ainsi que dans l’intervalle de 4 à 8 heures, on trouve une diminution de 2 04 pour l’albumose total, alors que l’albumose primaire transformé dans le même intervalle de temps est de 5.89 ; cette allure dans la décroissance de l’albumose primaire, indique que le deutéro-albumose se forme aux dépens de l’albumose primaire; par conséquent, aux différentes phases de la peptonisation, le liquide doit contenir des quantités variées de deutéro-albumose, quantités qui ne seront pas en rapport avec le laps de temps de la digestion. Dans la rubrique « deutéroalbumose total » nous trouvons, en effet, cette marche irrégulière; tandis qu’après 2 heures, on trouve 18.56, après 4 heures, lorsque la peptonisation est déjà beaucoup plus avancée, la quantité de deutéro-albumose n’a pas diminué; après 8 heures, on arrive même à une notable augmentation : 22.78 ; mais ensuite commence la période de décroissance et après 72 heures, on ne trouve plus que 6.27.
Cette marche ascendante et descendante se retrouve dans chacun des trois deutéro-albumoses. De plus, on peut constater que les différents deutéro-albumoses ne se produisent pas exclusivement au détriment de l’albumose primaire ; en effet.
ÉTUDE DES ALBUMOSES.
entre 4 et 8 heures, le deutéro-albumose B a augmenté de 8.58 à 15.53, il s’en est donc formé 6.95, tandis que, dans ce même temps, l’albumose primaire n’a perdu que 5.89 ; le deutéro-albumose B se trouve donc formé en partie par le deutéro-albumose A. La même observation peut se répéter à propos de la formation du deutéro-albumose C : entre 24 et 48 heures, cette fraction a augmenté de 3.52 à 7, tandis que l’albumose primaire a diminué seulement de 1.12 à 0.7.
Pour avoir une idée plus nette de la répartition des albumoses au cours de la peptonisation, il faut déterminer la proportion de chaque fraction dans la quantité totale d’albumose présent à chaque prise d’échantillon. L’analyse des échantillons prélevés nous montre que les quatre albumoses se retrouvent à chaque phase de la peptonisation dans des proportions différentes. L’albumose primaire est le produit qui se forme le plus abondamment dès le début de l’action de la pepsine ; il disparaît assez rapidement, en laissant un petit résidu, composé principalement d’hétéro-albumose. Sa proportion centésimale augmente à la fin, du fait de la transformation de l’albumose total en peptone. La deutéro-albumose A , tout en arrivant à son maximum plus tard que l'albumose primaire, disparaît plus vite que ce dernier. Le deutéro-albumose C arrive à son maximum quand la peptonisation est plus avancée ; il a les caractères d’un produit plus dégradé.
Répartition de l’albumose dans les différentes phases
DE PEPTONISATION. POUR 100 ALBUMOSE :
Durée
de l’expérience.
Heures.
Albumose
primaire
Deutéro-
albumose
Deutéro-
albumose
Deutéro-
albumose
PEPSINE
Les différences que l’on constate dans les proportions des divers albumoses, l’augmentation très sensible del’albumose C, la diminution de l’albumose primaire, la disparition du deutéroalbumose A, sont autant de données qui parlent plutôt en faveur de l’existence de plusieurs variétés d’albumoses, car la même substance arbitrairement partagée ne pourrait pas présenter des propriétés si spéciales.
Au point de vue de la répartition des albumoses, on peut obtenir des résultats plus précis en étudiant la peptonisation sous l’action d’acides faibles. Par l’action de l’acide sur la matière albuminoïde, on obtient, d’après Goldschmidt, les mêmes albumoses qu’avec les enzymes; mais la transformation par les acides étant beaucoup plus lente, on peut suivre aisément la marche de l’hydratation et mieux saisir le moment correspondant à l’apparition de chacun des albumoses.
Apparition des différents albumoses au cours
DE L’HYDROLYSE PAR HCl.
Dose d’acide :
Durée d’expérience:
Température :
HCl 1/4 N.
Après 1 h. 40« 0.
HCl 1/4 N.
Après 18 h.
HCl 1/4 N.
Après 48 h.
HCl 4 N.
Après 16 h.
Albumose primaire . .
Deutéro-albumose A. .
Deutéro-albumose B. .
Deutéro-albumose C. .
Le signe -f- marque la présence d’albumoses, le signe — l’absence. Ces essais, avec l’ovalbumine, nous montrent que, selon la concentration de l’acide et la durée de l’expérience, on peut aboutir exclusivement au deutéro-albumose B ou à l’albumose primaire et au deutéro-albumose B, ou encore à l’albumose primaire, et les deutéro-albumoses A et B.\
Ces résultats sont très favorables à la méthode de précipitation fractionnée. Ils confirment aussi ceux obtenus précédemment avec la pepsine. L’albumose primaire et le deutéroalbumose B sont les produits qui se forment d’abord ; le
ÉTUDE DES ALBUMOSES.
deutéro-albumose A est un produit secondaire et le deutéroalbumose C n’apparaît que comme un produit final de la transformation. Cette fraction se forme difficilement en présence des acides et ne se rencontre en appréciable quantité que dans les dernières phases de la peptonisation.
Marche comparée de la transformation de Palbumose primaire et des deutéro-albumoses. — Autant qu’on peut en juger par les expériences citées dans les paragraphes précédents, l’albumose primaire disparaît graduellement pendant la marche de la peptonisation. Il était donc intéressant d’étudier ce point, étant donné la marche différente des trois autres fractions d’albumose. Effront a fait quelques essais à ce propos avec l’albumine d'œuf. Voici les conditions dans lesquelles il s’est placé pour ces expériences : Les blancs d’œuf sont passés à travers un filtre en soie. Le liquide dilué avec l’eau distillée est ensuite filtré sur un filtre en papier, puis amené à une teneur de 3 % d’albumine. Par litre de liquide on ajoute 500 centimètres cubes d’acide dilué contenant 3 grammes d’acide chlorhydrique et 1 décigramme de pepsine. On laisse agir pendant une demi-heure à 50°; on refroidit, on neutralise avec la soude, et le liquide, débarrassé de syntonine, est porté à l’ébullition pour coaguler l’albumine non transformée. Le liquide filtré est à nouveau additionné d’acide chlorhydrique jusqu’à une teneur de 3 grammes par litre. On ajoute 1 décigramme de pepsine et on laisse digérer à 40° dans un flacon fermé. A différentes reprises, on prélève des échantillons, dans lesquels on précipite l’albumose primaire. D’après la teneur en azote du précipité obtenu, on établit la quantité d’albumose primaire présent dans le liquide aux différentes phases de la peptonisation.
( Voir tableau comparatif, page 242.)
Pour la détermination de l’albumose primaire, dans tous les échantillons on a prélevé 20 centimètres cubes de liquide, on a ajouté 0.4 centimètres cubes d’acide sulfurique dilué et 17 centimètres cubes de solution saturée de sulfate de zinc acidifié. On laisse 24 heures au repos ; on filtre ensuite le
PEPSINE
Disparition graduelle de l’albumose.
Albumose primaire pour 100 de liquide milligrammes.
Au début 481
Après 30 minutes 421
» 60 minutes 369
» 1 heure 1/2 312
» 2 heures 284
précipité et on le lave à cinq reprises avec une solution saturée à moitié de sulfate de zinc.
Au début de la deuxième peptonisation, le liquide, débarrassé de syntonine et d’albumine non transformée, contenait 690 milligrammes d’albumose total. Comme albumose primaire on a trouvé 481 milligrammes. Dans un liquide aussi riche en albumose primaire, on peut suivre facilement sa disparition progressive pendant la peptonisation. Dans les quatre premiers échantillons, pris du début à 1 heure et demie, on constate, jusqu’à un certain point, une proportionnalité entre le temps et le produit transformé. Dans l’échantillon suivant on voit déjà un ralentissement très prononcé, puis la quantité d’albumose va toujours décroissant. Cette disparition graduelle est très caractéristique pour l’albumose primaire. Cette particularité ne se retrouve pas dans les trois deutéro-albumoses ; la précipitation fractionnée nous apporte donc une séparation réelle entre les produits transformés, puisque, des quatre fractions obtenues, en voici déjà une au moins absolument distincte des trois autres.
Les natures différentes des albumoses peuvent aussi être reconnues par les actions diverses de la pepsine sur chaque fraction. Les essais qu’EFFRONT a poursuivis dans cette voie ont donné des résultats assez satisfaisants. La solution d’albu-
Durée de l’action.
ÉTUDE DES ALBUMOSES.
mine d’œuf à 5 % est soumise à l’action de la pepsine. On arrête la peptonisation après 12 heures, et le liquide, après neutralisation, ébullition et filtration, est partagé en 2 parties. Dans la première partie on précipite séparément l’albumose primaire, puis ensemble les 3 deutéro-albumoses. Dans la deuxième partie, on précipite le deutéro-albumose C, après avoir débarrassé le liquide de tout autre albumose. Les trois précipités sont lavés, purifiés; on fait avec chacun d’eux une solution ainsi composée : 1 gramme et demi de substance, dissoute dans 100 centimètres cubes d’acide chlorhydrique à 0.3 %. On ajoute 5 centigrammes de pepsine et on laisse dans un flacon fermé à 40°. A différentes reprises, on prélève des échantillons, dans lesquels on détermine chaque fois la quantité de peptone formée (substance non précipitable par les sels).
Formation de peptone avec les différents albumoses.
Produits employés
Peptone formée dans 100 cm3 de liquide
Après 4 heures
Après 12 heures
Après 24 heures
Albumose primaire
Deutéro-albumoses
Deutéro-albumose C ... .
Si l’on compare la quantité de peptone formée par l’albumose primaire avec celle formée par les deutéro-albumoses, on voit que la peptonisation des deux produits ne marche pas de pair. L’albumose primaire se peptonise facilement, tandis que la transformation des deutéro-albumoses est beaucoup plus lente. Après 12 heures d’action, on obtient 0.92 gr. avec l’albumose primaire, 0.74 gr. avec les deutéro-albumoses. Après 24 heures, on a 1.1 gr. avec l’albumose primaire et 0.89 gr. avec les deutéro-albumoses. On peut donc en conclure la nonidentité de ces deux fractions ; de plus, on peut conclure aussi à la non-homogénéité des deutéro-albumoses, puisque la marche de peptonisation du deutéro-albumose 6 est tout autre que celle du mélange des deutéro-albumoses. Le deutéro-albumose C
PEPSINE
fournit, après 24 heures, 0.33 gr. de peptone au lieu de 0.89 gr. formés par le mélange des deutéro-albumoses.
En résumé, la méthode de précipitation fractionnée fournit des résultats certains dans les solutions ne contenant qu’une seule espèce de matières albuminoïdes. Dans certains cas seulement, elle peut être appliquée à l’analyse d’un mélange de matières protéiques. En ce qui concerne l’étude des produits de transformation des matières albuminoïdes par les acides ou les enzymes, elle permet de mettre en évidence l’existence d’un certain nombre de dérivés. Les 4 albumoses qu’on obtient par la méthode de précipitation fractionnée doivent être envisagés comme le groupement de corps distincts, et non comme la même substance divisée artificiellement. L’individualité de chaque fraction est attestée par ce fait que, suivant les conditions où l’on se place, on peut aboutir à l’un ou l’autre albumose, et que l’apparition ou la disparition de chacun de ces groupements correspond à des moments différents, dépendant de l’étendue de l’hydrolyse. L’albumose primaire diffère des deutéro-albumoses par la propriété suivante : sous l’action de la pepsine, il se transforme graduellement, c’est-à-dire que la quantité dosée dans les prises d’échantillon pendant les essais diminue ou reste stationnaire, mais n’augmente jamais. Les deutéro-albumoses A et B, qui se forment aux dépens l’un de l’autre, et aussi de l’albumose primaire, accusent, au contraire, pendant la peptonisation, deux ou plusieurs maxima. Quant au deutéro-albumose 6, il se comporte d’une façon tout autre que l’albumose primaire et les deutéro-albumoses A et B, vis-à-vis de la substance active, ou encore, de l’acide dilué.
Toutefois, il reste bien entendu que les 4 albumoses ainsi obtenus, tout en manifestant des propriétés distinctives, ne sauraient être envisagés comme des corps chimiques proprement dits, bien homogènes, mais plutôt comme des groupements de corps. C’est ainsi que l’albumose primaire est composé de proto-albumose et d’hétéro-albumose, ce dernier étant caractérisé par le précipité qu’il donne avec l’acide nitrique à froid, ou bien avec l’acétate et le sulfate de cuivre.
PEPTONES ET CORPS ABIURÉTIQUES COMPLEXES. 245
Dans le deutéro-albumose A, Zunz distingue deux fractions ; enfin le deutéro-albumose C ne peut être considéré davantage comme une substance unique, puisque sous l’action de la pepsine il se comporte comme un mélange de deux parties, l’une sensible et l’autre insensible à l’action de l’enzyme. Quoi qu’il en soit, et malgré ses imperfections, la méthode de précipitation fractionnée, en établissant une distinction, même grossière, entre les différents produits de la protéolyse, permet de suivre la formation de ceux-ci au cours de l’action des enzymes digestifs; elle est donc à même de rendre de précieux services dans l’étude du travail chimique qui en résulte.
Peptones et corps abiurétiques complexes résultant de l’action de la pepsine.
Azote formol et azote amide.
Des données qui précèdent, il résulte qu’au cours de l’hydrolyse, quatre albumoses apparaissent qui peuvent être envisagés eux-mêmes comme des groupements de plusieurs corps distincts, différant par un certain nombre de propriétés. La fraction qui ne précipite plus par le sulfate de zinc en milieu acide porte le nom d epeptone. Cette partie importante fournit la réaction du biuret et se trouve formée par des dérivés encore complexes des albuminoïdes. De plus, elle précipite par l’acide phosphotungstique. Toutefois, cette précipitation n’est pas complète. Dans la partie insolubilisée se trouvent les fractions donnant la réaction du biuret : on les considère comme formées par les acides diaminés et des acides monoaminés complexes. Dans la partie restée en solution se trouvent des polypeptides encore très élevés ne donnant pas la réaction du biuret. On sait que l’acide phosphotungstique est employé couramment pour séparer les acides monoaminés de structure simple des dérivés complexes. Comme l’ont déjà montré Wetzel et Kutscher,
PEPSINE
ainsi que Schmied, cette séparation n’est pas complète : les essais, pour avoir quelqu’intérêt, doivent être exécutés dans des conditions strictement déterminées et les résultats obtenus ainsi n’ont en définitive qu’une valeur comparative.
La partie de la peptone précipitable par l’acide phosphotungstique est désignée quelquefois sous le nom de vraie peptone, appellation qu’il ne faut pas confondre avec celle de peptone commerciale , sous laquelle on vend le produit complexe dérivant de l’hydrolyse pepsique de la fibrine ou autres, et qui est surtout composée par des albumoses. Pour doser la vraie peptone, on ajoute au liquide de digestion, débarrassé au préalable des albumoses (1) qu’il contenait, 1/2 vol. de S01 * * 4H* dilué (à raison de 1 volume d’acide pour 3 volumes d’eau) ; puis on introduit, petit à petit et en agitant, une solution à 10 % d’acide phosphotungstique de Merck, jusqu’à ce que le précipité formé n’augmente plus. On laisse 24 heures au repos à 35-40° et on filtre. La différence entre l'azote du liquide avant l’addition d’acide phosphotungstique et après la filtration donne l’azote précipité. En se servant successivement, comme moyen de précipitation fractionnée, du S04Zn, puis de l’acide phosphotungstique, Zunz est arrivé à suivre suffisamment bien le travail digestif produit par la pepsine agissant sur la séroalbumine cristallisée.
( Voir tableau comparatif, page 247.)
Ce tableau nous montre que la peptone vraie (rubrique V), correspondant à l’azote précipitable par l’acide phosphotungstique, très faible au début, augmente graduellement au cours de l’hydrolyse : l’azote, sous cette forme, atteint à la fin de la digestion, après 30 jours, 63.09 % de l’azote total. L'azote non précipitable par l’acide phosphotungstique est déjà considérable après 4 heures d’action : soit 23.4 %. Il augmente rapidement pour arriver à un maximum, soit 50.51 °/0, puis il
(1) Le dosage de l’azote albumose se fait en acidifiant la liqueur à analyser avec
du S04 Ha dilué au 1/4 en volume, à raison de 2 cc. pour 100 cc. de liquide, puis en saturant
le tout avec du S04 Zn, qu’on ajoute sous forme de cristaux en excès. Après 24 heures, le précipité est recueilli, lavé avec une solution saturée de SO* Zn acidifiée, comme précé-
demment, puis traité pour la détermination de l’azote par la méthode de Kjehldahl.
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Disparition progressive des différents albumoses AU cours de la digestion pepsique de la sero-albumine.
Temps de la digestion
Azote pour 100 contenu dans les
Albumoses
Autres produits de la digestion
Total
Total
4 heures
2 jours
