CH2 + CH20 = H20 + CH2 <^C02H

La mesure de l’acidité indiquera, par suite, la quantité d'acide aminé contenue dans la solution. Un pareil phénomène se passe avec les produits de la protéolyse. La molécule albuminoïde étant constituée par des radicaux divers unis par les liaisons — CO — NH — , chaque fois qu’on fixe en un de ces points une molécule d’eau, la chaîne s’ouvre et il apparaît un groupement carbonyle acide et un groupement amine basique. Ces deux fonctions se saturant mutuellement, la réaction du milieu n’est pas sensiblement changée. Mais vient-on à ajouter dans la liqueur parfaitement neutre une solution de formol, on constate aussitôt que le liquide devient acide. C’est qu’en

MÉTHODES D’ANALYSE

effet le groupe — NH2, en réagissant avec l’aldéhyde formique GH20, s’est transformé en — N = CH2, qui est une forme neutre, et le groupe C02H a pu se manifester dans toute sa plénitude. On pourra dès lors le doser au moyen d’une solution titrée, de baryte, par exemple. Plus l’hydrolyse sera profonde, plus il y aura de chaînons rompus et plus grand sera le nombre de C02H à saturer. Naturellement, à chaque C02H dosé correspond au moins un groupe NH2 formé. Mais comme il y a aussi, parmi les débris albuminoïdiques, des corps à deux ou trois azotes, et qu’on ne sait pas, d’autre part, ni leur quantité, ni à quel moment ils sont libérés, on ne pourra les compter que comme dérivés monoazotés, de sorte qu’on commettrait une erreur par défaut si, après avoir converti le nombre de cc. d’alcali employés pour la saturation en mgr. d’azote titrable au formol, on considérait ce résultat comme représentant la quantité d’azote réellement séparée de la molécule albuminoïde.

Quoi qu’il en soit, voici comment on procède pour l’analyse. On prépare tout d’abord les réactifs suivants :

1) Une solution de phénolphtaléine correspondant à 0.5 °/0 de phénolphtaléine dans de l’alcool à 50 %.

2) Du papier de tournesol très sensible, obtenu ainsi : on pulvérise finement 0 gr. 5 d’azolitmine, qui est la matière colorante du tournesol, et on la dissout dans 22.5 cc. de soude N/10, puis on dilue le tout avec 200 cc. d’eau. Après filtration, on ajoute à la liqueur 50 cc. d’alcool et Ton trempe rapidement dans cette teinture des bandes de papier contenant très peu de cendres. Après séchage, les bandes sont conservées dans des flacons bien secs en verre brun. Ce papier doit avoir un ton neutre et être faiblement teinté, car sa sensibilité est plus grande ainsi. Il doit réagir de la façon suivante avec ces mélanges de divers phosphates de soude :

Eau -f- 3 parties P04HNa2 7 parties P04H2Na : faible réaction acide.

» + 5 » » +5 » » : réaction neutre.

» + 7 » » +3 » » : faible réaction alcaline.

Si, en raison de la qualité du papier employé, les bandes qu’on a préparées ne répondent pas aux essais précédents, on

les recommencera après avoir corrigé en conséquence la teinture de tournesol par l’addition d’une certaine quantité de soude N/10.

3) Une solution de formol, qui doit être préparée au moment de s’en servir. Pour cela, à 50 cc. de formol commercial on ajoute 1 cc. de la solution de phénolphtaléine précédente et, goutte à goutte, la quantité de soude N/10 nécessaire pour obtenir une légère teinte rose. Cette solution, dans les conditions où on l’emploie, doit subir une correction. Pour déterminer celle-ci, on prend 20 cc. d’eau distillée bouillie. Si le liquide de digestion dans lequel on exécutera le dosage est coloré, on ajoutera à cette eau distillée quelques gouttes d’une solution très diluée de tropéoline ou de brun Bismarck, afin de l'amener à la même teinte et de rendre ainsi les virages comparables. On ajoute alors à cette eau 10 cc. de la solution de formol et l’on titre cette liqueur de contrôle. Pour cela, on l'additionne d’environ 5 cc. de soude N/10, et l’on ramène avec HCl N/10 la coloration produite à celle d’une légère teinte rouge, puis on ajoute de nouveau deux gouttes de soude N/10, ce qui fait prendre à la liqueur type une teinte rouge vif, qui devra être la même pour toutes les analyses.

Si, par exemple, on a employé en tout 5 cc. 15 de soude N/10 et 5 cc. d’HCl N/10, la différence, soit 0.15 cc. de soude, représentera la correction pour 10 cc. de formol, qu’on devra retrancher du résultat donné par le liquide étudié. Au contraire, si l’on avait employé 0 cc. 15 d’HCl de plus que de soude, la correction aurait été additive.

4) Une solution saturée de baryte Ba(OH)2 dans l’alcool méthylique.

Voyons maintenant comment on conduit l’analyse. Pour obtenir des résultats satisfaisants, il importe tout d’abord d’employer une quantité de substance telle qu’on soit conduit à utiliser environ 5 cc. de soude N/10, et, de plus, il est bon de répéter deux ou trois fois chaque détermination. Si la solution renferme de l’ammoniaque, il est préférable de la chasser d’abord, celle-ci n’étant titrée que d’une façon incomplète par

MÉTHODES D’ANALYSE

la méthode au formol. On place alors le liquide en expérience dans un récipient haut et étroit, on y ajoute 1 cc. de solution de phénolphtaléine, 2 gr. de BaCl2 et un demi-volume de la solution saturée de baryte dans l’alcool méthylique. On fait ensuite passer, pendant plusieurs heures, un violent courant d’air dans le liquide et l’on reçoit l’ammoniaque entraînée dans un flacon contenant du S04H2 N/10, dont la variation de titre donnera au surplus la teneur en N ammoniacal. La liqueur, dépouillée d’ammoniaque, est alors amenée à un volume donné, puis filtrée ; une partie aliquote va servir maintenant au dosage des acides aminés. Pour effectuer celui-ci, on neutralise exactement le liquide avec HCl N/10, en s’aidant du papier tournesol très sensible, puis on ajoute 10 cc. de solution de formol ; on verse à ce moment la solution de soude N/10 jusqu’au virage rouge, et l’on en met un excès de 5 cc. ; on titre alors par retour, avec HCl N/10, jusqu’à obtention de la coloration rouge faible, et, au moyen de quelques gouttes de soude N/10, on amène la teinte pareille à celle de la liqueur de contrôle.

La neutralisation exacte au papier de tournesol est toujours assez fastidieuse. Si l’on dispose d’une quantité suffisante de liquide, et si celui-ci est peu coloré, on peut, sur une moitié, faire la neutralisation en présence de quelques gouttes de teinture de tournesol ajoutées au liquide même, et verser ensuite dans l’autre moitié, la même quantité d’HGl N/10 qu’on a employée pour la saturation de la première.

Si la liqueur examinée ne contient pas d’ammoniaque, on ajoute directement, à un volume connu de celle-ci, 1 cc. de phénolphtaléine, 2 gr. de BaCl2, de la baryte, jusqu’à l’apparition de la coloration rouge, puis un excès de 5 cc. ; on amène le tout à 100 cc., on agite vigoureusement, on laisse 1/4 d'heure au repos, on filtre s’il y a lieu, et sur une partie aliquote on procède au dosage, comme plus haut.

Dans le calcul de l’azote formol on ne fait, naturellement, intervenir que la quantité de soude qui a servi à partir du moment où la solution a été exactement neutralisée au tournesol. Voici les divers nombres qu’on a obtenus en appli-

TRYPSINE.

quant la méthode à une solution de glycocolle à 2 % : 10 cc. de cette solution, contenant par conséquent 0 2 gr. de substance, soit 0.0344 gr. N total, sont additionnés de 10 cc. de phénolphtaléine, de 2 gr. BaCl2 et de 8 cc. de Ba(OH)2 : on complète à 100 cc., on agite, on abandonne 1/4 d’heure et l’on filtre. 25 cc. du filtrat, soit 2.5 cc. de la liqueur primitive, exigent pour leur neutralisation, en présence de papier tournesol,

7.5 cc. HCl N/10. A ce moment, on a ajouté successivement : 6.1 cc. de soude N/10 (coloration rouge faible) + 5.5 cc. de soude N/10 (excès), soit en tout : 11.6 soude. Puis, avec 5.75 cc. HCl N/10, on est revenu à la teinte rouge faible. Enfin, 0.1 cc. de soude N/10 ont donné la teinte rouge typique de la liqueur de contrôle. On a donc employé : 11.7 cc. de soude (le formol avait une correction nulle) — 5.75 HCl, ce qui fait : 5.95 cc. N/10, soit 5.95 X 1.4 = 8.33 mgr. N. Or, les

2.5 cc. de liqueur contiennent effectivement 8.6 mgr. de N : le dosage d’azote formol représente donc 98.1 % de l’azote total.

Voici maintenant les résultats trouvés avec le liquide d’une digestion trypsique de caséine : 100 cc. de liquide filtré, débarrassé par un peu d’acide acétique de la caséine non transformée, contiennent 240 mgr. N total; 50 cc. de ce liquide, traités par BaCl2 et Ba (OH)2 alcoolique, ont donné une quantité de NH3 telle, que sa saturation a exigé 2.5 cc. S04H2 N/10, soit 2.5 X 1.4 = 3.5 mgr. N, c’est-à-dire 7 mgr. d’azote ammoniacal pour 100 cc. de liquide primitif. Le liquide débarrassé de NH3est amené à 100 cc. On en prend 50 cc., qu’on neutralise exactement au papier de tournesol, puis on verse les 10 cc. de formol. On ajoute alors : 13.0 cc. soude N/10; puis 5.4 cc. HCl N/10; puis 0.2 cc. soude N/10.

D’autre part, la correction du formol était de — 0.1 cc.; on a donc employé : 13.0 — 5.4 4- 0.2 — 0.1 = 7.7 cc. soude N/10; soit 7.7 X 1.4 = 10.78 mgr. N; d’où : 10.78 X 4 = 43.12 mgr. de N formol pour 100 cc. liquide primitif.

Ce liquide de digestion contient donc :