Préparation de la culture pure

Une culture véritablement pure ne peut être obtenue acec certitude que par l’ensemencement d”une seule cellule. Une telle culture est la condition indispensable pour des

recherches exactes sur les microorganismes. Gomme cela a été signalé plus haut, ces recherches peuvent avoir des buts dilïérents : celui de suivre l’indicidu, la celhde isolée dans les phases de son développement , c’est l’étude inorpkoloniqueou bien celui d’étudier les conditions vitales des V'éfjétations qui sont nées de la cellule isolée, c’est l’étude bioloqiqne et plujsioloqique) . De même que ces deux méthodes d’analyses sont très distinctes, de même les manières de procéder devront être complètement diHérentes.

«I. — Cultures paires pour les éludes du développement et pour les recherches morphologiques.

De même que l’on trouva antérieurement, par l’examen delà levure au microscope, que celle-ci se composait de cellules, de même aussi l’on chercha bientôt, par l’examen d’une seule de ces cellules, à déterminer comment elle se multipliait et sous quelles formes apparaissaient les nouvelles générations. On faisait donc un examen morphologique d’une culture pure. 11 fallait alors s’arranger de manière à ce que l’observation ne fut pas dérangée par d’autres cellules, pouvant entraver la cellule choisie dans sa reproduction, ou la cacher aux yeux de l’observateur. Il ne fut d’ailleurs attaché aucune importance à des cellules étrangères qui auraient pu se présenter dans d’autres parties de la préparation, ou en général dans toute la préparation.

lîhrenherg a déjà observé en 1821, par des investigations de ce genre, la germination de quelques spores de champignons. Plus tard Mitscherlich, h'ützing (1851) et F. Schulze (1860) ont observé de la même manière la multiplication des cellules de levure. On diluait une petite quantité de levure haute avec du moût de bière jusqu’à ce qu’elle ne contienne plus qu’une ou deux

cellules de levure; avec une de ces gouttes, on faisait une préparation ordinaire que l’on scellait et que l’on regardait directement au microscope pour étudier le développement de la cellule. Plus lard Tulasne (1861) et surtout (le Bary (1866), employèrent principalement le même procédé dans leurs célèbres recherches sur la germination des spores des champignons. Brefeld alla plus loin dans ses recherches et suivit le développement du mycélium formé par la spore jusqu’à ce que celui-ci eut de nouveau produit des spores. 11 semait les spores sur le porte-objet. Si la durée de l’examen devait dépasser le temps qui suIBsait à l’évaporation d’une goutte de liquide de dimension ordinaire, il ajoutait de la gélatine au liquide; au-dessus de l’appareil, on plaçait un petit écran en papier que l’on fixait au microscope pour tenir à l’écart, autant que possible, les germes étrangers. Quand le développement se faisait dans des gouttes ordinaires de liquide, on plaçait la préparation pendant l’intervalle entre les observations, sous une cloche humide de verre. Il ne fut donc pas procédé à un examen ininterrompu, ce qui n’eut pas môme été possible pour les champignons de plus grande espèce. D’après toute la disposition de l’expérience, il ne peut donc être ici question de cultures absolument pures; mais comme cela a été dit plus haut, cette recherche pourra bien être exécutée avec de la matière impure.

b. — Cultures pures pour expériences physiologiques sur (les cultures eu tuasse.

Si, par contre, le but de la culture pure est de servir à des études biologiques ou physiologiques, de telle sorte qu’une cu/f lire en masse de la végétation soit nécessaire, un examen direct sur la table du microscope sera impossible et les procédés décrits plus haut ne pourront par

3U LKS MICnOOIlGANMSVIKS DE LA FERMENTATION.

conséquent pas être employés. Les méthodes que l’on applique clans ce but peuvent être résumées en deu.x groupes, savoir: les mélhodrs plujsioloçjùiup.s et les méthodi’s de dilution. Pour les premières, on emploie des liquides, pour les secondes comme matières diluantes, des liquides ou des gélatines.

fl. — Mélliocles pliysiolof'iques.

Les méthodes physiologiques qui furent employées par Pasteur, Colin et d’autres, émanant de l’idée que les espèces se trouvant dans un mélange, se multiplieront inégalement, en raison de leurs natures différentes, si toutes sont cultivées dans le même liquide nourricier, sous l’action de températures égales, et cela de telle façon que les espèces qui trouvent des conditions de nutrition défavorables seront peu à peu éliminées par l’espèce ou les espèces qui se trouvent dans des conditions de nutrition particulièrement favorables. Pendant la durée de ces recherches, on a employé des liquides très différents pour ces cultures, par exemple des liquides alcalins pour les végétations de bactéries; des liquides nourriciers acides pour enlever aux végétations de levure leurs bactéries (de l’acide lactique, de l’acide tartrique, de l’acide fluorhycjrique, etc.) Le point faible de toutes les méthodes de ce genre est que l’on est toujours obligé de prendre comme point de départ des éléments inconnus, c’est-à-dire le mélange impur. Il est donc impossible de savoir quels résultats un tel traitement amènera ; car il est dans la nature des choses que l’on agira toujours au hasard, et à vrai dire, il ne peut donc être ici question d’aucune méthode. 11 subsiste toujours la possibilité que les espèces faibles ne soient qu’entravées et réprimées, et non détruites; lorsque les espèces plus vigoureuses, après avoir atteint le point

culmirinnt de leur développement, entrent dans un étal de faiblesse, il y aura, par conséquent, chance pour que d’autres espèces commencent à se multiplier. Il y aura de plus encore toujours la possibilité, que non-seulement une, mais deux ou plusieurs espèces croissent avec la même facilité dans le liquide nourricier, et qu’elles se développent par conséquent avec une vigueur égale. Si l’on étudie par exemple de la levure de bière ordinaire, on pourra très souvent, à l’aide de la méthode de Hansen, éliminer de la même masse de levure plusieurs espèces différentes et typiques de levure dite de culture. Un exemple frappant qui fait voir les dangers que le traitement. physiologique peut introduire nous est fourni par le procédé que Pasteur indiqua pour la purification d’une levure de brasserie. La levure impure est introduite dans une solution de sucre de canne à laquelle on a ajouté une petite quantité d’acide tartrique. Le but que l'on se propose dans ce cas, est de délivrer la masse de levure des germes de maladie qui s’y trouvent mêlés. Les recherches entreprises par Hansen ont démontré que, si de cette manière on arrive ordinairement à arrêter ou à réprimer les bactéries qui se trouvent dans la masse de levure, les espèces de levure appelées levures sauvages, parmi lesquelles se trouvent aussi les levures de maladie, se (léoeloi)peront avec toute vigueur, et réprimeront même dans bien des cas complètement la levure de cnllure, c’est-à-dire la levure même que l’on désirait purilier. Les espèces des levures sauvages, les levures de maladie, n’existeraient-elles même au début qu’en quantité minime, pourront arriver, par le traitement Pasteur, à constituer la partie prédominante de la masse entière. Le traitement d’éléments inconnus, choisis sans méthode, a par conséquent mené au résultat opposé à celui que l’on se proposait d’atteindre. Même quand la masse de levure dont il s’agit ne se compose que de va-

LKS MIGROORGAMSMKS DE LA FERMENTATION.

riétés de levures sauvages, il est impossible, par le procédé indiqué de Pasteur, de préparer avec certitude une culture pure d’une espèce déterminée du mélange (').

Si maintenant nous demandons si l’on doit, en général, conseiller l’emploi d’un des procédés mentionnés pour purifier une levure inconnue et impure, la réponse sera, pour les raisons que nous venons d’indiquer, négative. Ceci est exact, peu importe que la culture serve à des usages scientifiques ou industriels, car dans les cultures ultérieures, h‘ dniuiei- up spra jamais érnrSé île voir dps espèces, toutes différentes de celle que l’on voulait obtenir, prendre le dessus. Si le point de départ est incertain, le résultat le sera tout autant, et des méthodes de ce genre doivent être considérées aujourd’hui comme surannées et complètement manquées. Elles ont, dans quelques circonstances, une certaine importance en tant qu’elles peuvent servir à préparer le développement d’une vraie culture pure. Dans les didérentes branches de l’industrie de la fermentation, il n’y aura qu’un seul chemin qui mène au but, c’est celui d’employer les principes suivis depuis des années déjà dans l’agriculture et l’horticulture, et- qui consiste à choisir, après des essais con-

(1) D'après le procédé de M. Eliront on emploie, dans les distilleries, l’acide fin or hydrique comme anLisei)lique. Un emploi de celle substance pour la purification d'un levainimpur— levure de brasserie ou de distillerie — comme le propose Eliront, entraîne avec lui les mêmes dangers iiue l'em|iloi de l'acide tartrif|ue mentionné plus haut. Des ex])érîences métbodi(|ues faites au laboratoire, de l'auteur ont démontré que, par le traitement d’un levain imiiur, d’après la lormnle d’ElIiont, le développement des levures sauvages et des unjcodermes peut être plus cousidêrable que celui des levures de culture: ou peut voir du même coup, qu’une espèce aussi dangereuse que le liacterium aceti résiste dans beaucoup de cas, à l'action du traitement; elle se multiplie même souvent plus énergiquement que dans les conditions normales, lor.siju’on emploie 1 acide Iluorbydriqne ou l'un de ses sels.

Ul’CHKRCHKS MlCROSCOl’lQUliS El’ PHYSIOLOGKjUES. 3*3

tonnes à un plan inéüiodicjue, la race particulière qui olire, dans les conditions données, les meilleurs résultats, pour ne se servir que de celle-ci pour l’ensemencement. Mais ceci n’est possible qu’en suivant la méthode de Hansen, sur laquelle nous donnerons des détails plus tard.

b. — Méthodes de dilution.

Les autres méthodes employées dans les études physiologiques sont les méthodes de dilution ou ce qu’on appelle les cultures fractionnées, et qui sont basées sur le principe qui consiste à diluer les éléments donnés, de telle façon que l’on arrive à la lin à n’avoir plus qu’une seule cellule. Dans la plupart de ces cultures, on ne calcule qu’avec des probabilités. Pour les ferments alcooliques, Hansen a, par contre, transformé ce procédé en une méthode exacte .

Lister (1878) est le premier qui a employé des méthodes de ce genre. Pour développer des cultures pures de bactéries d’acide lactique, il détermina, au moyen du microscope, le nombre de bactéries prises dans une très petite goutte de lait caillé, en les comptant dans plusieurs champs de la préparation, pour calculer ensuite leur nombre dans toute la préparation. Ensuite il calculait la quantité d’eau stérilisée nécessaire pour étendre la goutte, alin de pouvoir compter en moyenne moins d’une bactérie par gouttelette. Moyennant cinq de ces gouttelettes, il infecta cinq Hacons contenant du lait bouilli. Le résultat fut, que le lait se cailla dans un de ceux-ci qui contenait le Bactérinm lactis, tandis que les «[uatre autres flacons restèrent intacts et ne montrèrent aucune trace de bactéries, Nageli et Fitz ont, plus tard, employé le même procédé.

Pour des dilutions de ce genre, on a aussi employé l’air

(Pasteur): une petite portion de levure est dessécliée et réduite en fine poussière avec du plâtre. On laisse tomber d’une assez grande hauteur un nuage de cette poussière et, pendant la chute des particules, on ouvre plusieurs ballons dans lesquels on avait préalablement fait le vide (page 45). 11 pourra, de la sorte, arriver que des cellules de levure, disséminées dans le nuage, pénètrent isolément dans quelques-uns de ces ballons.

Comparée aux méthodes physiologiques, celle par dilution qui vient d’ètre décrite, marque un progrès visible; on s’est approché, à cet égard, sensiblement du but. Mais il est évident que, même si la dilution était assez forte, comme dans l’exemple précédent, où de plusieurs ballons un seul montra un développement, il n’est nullement prouvé que ce ballon isolé n’ait reçu qu’un seul germe. L’incertitude est donc encore très grande, même dans le cas où l’on peut procéder au dénombrement des individus avec lesquels on opère. Il sera, de plus, en ce qui concerne les bactéries, très difiicile et souvent même complètement impossible de les compter. L’e.xactitude de ces calculs reste en tous cas très problématique. La question qui se pose sera donc toujours celle-ci : comment distinguera- t-on les ballons qui n’ont reçu qu’une seule cellule, de ceux qui, malgré les prévisions du calcul, ont été infectés de plusieurs cellules? En ce qui concerne les bactéries on n’a, jusqu’à ce jour, trouvé aucun moyen d’y répondre.

Pour la levure, la question fut résolue par Hansen, qui perfectionna le procédé de telle manière qu’il le transforma en une méthode exacte (1881). 11 se servit d’une dilution avec de Veau, de la manière suivante : on dilue la levure développée dans le ballon, dans une proportion quelconque avec de l’eau stérilisée, et on compte le nombre de cellules contenues dans une gouttelette du liquide que l’on a vivement secoué. Dans ce cas, la déter-

RKCHERCHES MICROSCOPRjUES ET I*HYSIOLOG:QnES. 35

miaalion du nombre se fait en portant la goutte sur un couvre-objet, au milieu duquel sont gravés quelques petits carrés pouvant servir de points de repère à l’œil ; le couvre-objet se pose sur la chambre humide (Fig. 2). La goutte ne doit pas dépasser la limite des carrés. Gela fait, on procède au dénombrement des cellules contenues dans la goutte. Supposons par exemple qu’elle contienne 10 cellules; on porte alors une goutte d’égale grosseur du liquide, que l’on vient de nouveau de secouer fortement, dans un ballon contenant un volume déterminé, par exemple 20 cm’ d’eau stérilisée. Il y aura alors une certaine probabilité pour que ce petit balloia contienne à peu près 10 cellules. Si, après avoir secoué fortement et pendant longtemps le contenu, l’on en introduit maintenant 1 cm’ dans chacun des ballons d’une série de 20 renfermant le liquide nourricier, il sera probable que la moitié de ces 20 ballons auront reçu chacun une cellule. Mais le tout ne repose jusqu’à présent, comme dans le procédé de Lister, que sur une probabilité. Si on laisse les ballons en repos pour que le développement continue, on pourra espérer d’obtenir une culture pure dans quelquesuns d’entre eux. Cependant, on ne peut se baser sûrement sur cela et continuer ainsi les recherches. Mais Hansen réussit à ajouter un point qui, seul, donne de la certitude à cette expérience. Si l’on secoue très fortement les ballons infectés pour les laisser ensuite reposer tranquillement, les cellules isolées descendront au fond et resteront collées aux parois du ballon.

11 est évident que si le ballon contient par exemple trois cellules, celles-ci seront, après que le liquide aura été secoué, toujours ou du moins dans la plupart des cas, éloignées l’une de l’autre, de sorte que chacune se déposera isolément au fond. Au bout de quelques jours, on remarquera, en soulevant le ballon avec précaution, qu’une ou plusieurs taches blanches se seront formées

36 LKS MICROORGANISMES OE LA FERMENTATION.

au fond du ballon. S'il ne se t route qu’une seul tache, on aura obtenu la culture pure.

Il est évident qu’au moyen de ce procédé, on est à même d’introduire directement une cellule unique dans le ballon contenant le liquide nourricier.

C’est ainsi que Hansen prépara toutes les premières cultures pures avec lesquelles il lit ses e.xpériences fondamentales sur les ferments alcooliques.

Pour préparer les cultures employées dans les études physiologiques, on a aussi utilisé des substances nntritites solides. Vidée de cette méthode a été donnée par Schroeter (1872) qui, dans ses recherches sur les bactéries à pigment, employa entre autres des tranches de pommes de terre comme milieu nourricier. Il avait observé, que lorsque de ces tranches avaient été exposées à l’air pendant quelque temps, il se produisait à leur surface des taches et des gouttes de dilïérentes formes et couleurs. Chacune de ces taches contenait le plus souvent une espèce déterminée de microorganismes.

Koch a essentiellement développé et perfectionné cette méthode. Il préparait d’abord les cultures pures par inoculation en stries dans la gélatine nutritite. Plus tard, il a élaboré une méthode bien meilleure, celle de la culture sur plaques (1883). Le procédé est le suivant: on prend une parcelle de la culture impure que l’on délaie dans une grande quantité d’eau stérilisée. Puis on introduit de nouveau un peu de ce liquide dans un ballon (jui contient par exemple un mélange de bouillon et de gélatine chaufïée à 30“C. On agite le ballon pour répartir les germes et on en répand le contenu sur une grande plaque de verre, que l’on recouvre ensuite d’une cloche. Peu après, la gélatine se fige et les germes se trouvent alors pris dans la masse solide. Au bout de quelques jours, ils se développent en colonies, en formant .soit des points, soit des taches, visibles à l’œil nu. Selon Koch, la pureté des végétations

UKCHEUGHES MICUOSCOPIQUICS ET PHVSlOLOGIQUES. 37

dans la gélatine est indiquée, pour ce qui concerne les bactéries, en partie par leur aspect, leur couleur, leur forme, etc.

Dans un examen plus approfondi, on n’aperçoit cependant aucune dilïérence essentielle entre cette répartition des germes dans la gélatine liquide et celle que l’on obtenait précédemment par des dilutions dans des liquides. La môme incertitude subsiste, car ni l’examen microscopique de l’aspect delà colonie, ni l’examen microscopique de son contenu, ne nous donnent la certitude qu’elle ne contienne qu'une seule espèce.

Le seul moyen de s’assurer de la pureté absolue d’une culture dans la couche de gélatine est d’observer directement le germe isolé et d’en suivre le développement.

Hansen l’a fait pour les cellules de levure et il a élaboré la méthode suivante : la couche de gélatine formée par le liquide nulrilif figé, est étalée de manière à ce que l'on puisse coir au microscope où se troucent les germes isolés. La position de ces germes est alors soigneusement marquée, et l’on est désormais à môme de suivre pas à pas le développement et la multiplication de la cellule.

La plaque de verre est un couvre-objet d’à peu près 30 de diamètre. Celui-ci est lixé sur un anneau de verre qui est lui-mème placé sur un verre plus épais, et qui constitue donc une de ces chambres humides décrites précédemment (voir Fig. 2, page 11) qui est appropriée au but que l’on poursuit et qui porte à la surface inférieure du couvre-objet une couche solide de gélatine. Le point essentiel de la méthode de Hansen est donc que contrairement à Koch, il suit d’une manière conséquente le principe, que le point de départ d’une culture pure doit être une cellule unique. Les germes doivent être tellement répartis, qu’il ne s’en trouve que relativement peu dans la couche de gélatine; on laisse alors la chambre humide sous le microscope pour suivre directement la multiplication des germes, ou bien l’on note, en divi-

38 Ll-:s MlCaOOUUANISMKS DK LA FKUMENTAÏION.

sant la plaque de verre en pelits carrés ou en employant le marqueur, l’endroit où se trouvent les. germes sûrement isolés, et l’on place l’appareil dans une étuve, jusqu’à ce que les colonies soient complètement développées. On peut avoir, à un couvre objet, 50 à 60 germes bien isolés. Quand les colonies sont développées, elles doivent être introduites dans le ballon au moyen d’un lil de platine préalablement rougi. Pendant l’ensemencement, la culture se trouve un instant à l’air et exposée à l’infection. Mais sur ce seul point faible, le jeu du hasard est réduit à son minimum, si l’opération décrite a lieu dans un espace restreint, exempt de germes, par exemple dans une petite caisse à parois de verre assez grande pour abriter les appareils et les mains de l’opérateur (voir page 18). De celte manière, l’ensemencement de la colonie se fait avec toute la sûreté possible. Du premier ballon la culture pure peut être introduite sans infection dans des ballons toujours plus nombreux et plus grands. La méthode de Hansen s’est donc autant que possible rapprochée du but, et elle s’emploie par conséquent partout où l’on se livre à des travaux exacts de ce genre.

Déjà, en 1883, Hansen a soumis la méthode des cultures sur plaques de h'och à un contrôle. 11 prépara un mélange de deux espèces de levures pouvant être distinguées au microscope, c’est-à-dire le Saccharomyces apicutatas et ime espèce du groupe de Saccharomyces ceretisiic. Le mélange fut introduit dans du moût gélatine et, après avoir été agité, il fut répandu sur une plaque de verre. Près de la moitié des taches formées contenait chaque espèce isolée, et dans une tache on trouva les deux espèces.

Plus lard, M. Miquel (1888) a appliqué un contrôle semblable pour les bactéries. 11 prit dans une culture sur plaques, provenant d’une analyse d’air, 100 colonies qui furent introduites dans 100 ballons contenant du bouil-

Ion peptonisé. L’examen des végétations qui se développèrent dans ces ballons démontra que celles-ci contenaient 134 espèces diiïérentes de microorganisnies. Ceci provient sans doute de ce qu’en remuant le mélange gélatiné, il est très dilbcile, et souvent complètement impossible, de séparer toutes les bactéries et les autres germes les uns des autres. Cet examen prouve donc que la culture sur plaques employée pour les bactéries peut entraîner des erreurs considérables.

M. Holm (1891) a soumis, pour un grand nombre d’espèces de levures, la méthode à une analyse minutieuse, en employant pour la préparation de cultures absolument pures, le procédé de Hansen qui a été décrit plus haut. Le résultat de 23 séries d’essais eflectués avec des mélanges distincts fut que dans un seul cas, 100 colonies avaient été formées par 100 cellules; dans toutes les autres séries on trouva des erreurs. Dans le cas le plus défavorable 100 colonies avaient été formées par 135 cellules, et la moyenne de tous ces essais lit voir qu’en moyenne 100 colonies avaient été formées par 108 cellules. Par là, il est démontré que le procédé sur plaques est également défectueux pour la levure.

La méthode de Hansen pour la culture pure de la levure a donc, comme avantage sur celle de Koch son point de départ sûr. En l’épétant même plusieurs fois les cultures sur plaques, on ne sait cependant jamais si le but est réellement atteint ou non. En ce qui concerne les bactéries, il sera toutefois, dans la plupart des cas, impossible de s’assurer le point de départ d’une cellule unique. Dans des cas pareils, la culture sur plaques de Koch est toujours la meilleure méthode dont nous disposions.