CHAPITRE PREMIER

I. — Préparations microscopiques. ~ Colorations et analyses microchimiques.

Le mirroscope sera toujours le principal au.\iliaire dans ^l’étude des inicroorganisines, ceu.x-ci étant, à l’état d’individu, presque toujours invisibles à l’oeil nu. C’est aux recherches purement microscopiques qye nous devons les premières observations importantes sur la physiologie de la fermentation, et il n’y a que quelques dizaines d’années que les études biologiques et physiologiques s’y associèrent. Après que l’on eut établi avec une certaine probabi lité, qu’une môme espèce de microorganismes ne se produisait pas toujours sous la même forme, un travail actif commença dans difïérents laboratoires, avec ce que l’on est convenu d’appeler des a essais de culture ». En modifiant artificiellement les conditions d’existence, on s’efforça d’étudier les difïérents degrés de développement d’une même espèce, afin d’en déterminer toutes les phases. L’idée était juste, mais l’exécution tellement défectueuse à cette époque, que les a essais de cullure)) risquèrent de tomber complètement en défaveur. On opérait sans aucune critique, comme le montre l’exemple suivant: on sema de la levure de bière sur une tranche de pain humide, puis on couvrit soigneusement la culture d’une

4 LUS MICUOOnGAMSMlî.S DK LA FEIiMKNTATIOX.

cloche en verre, en prenant toutes les précautions possibles pour garantir la végétation de tout corps étranger. Au bout de quelques jours il se forma, comme cela a toujours lieu sur du pain humide, un couche de moisissures et l’on en conclut que la levure de bière était le point de départ des formes de moisissures et que par conséquent, la levure et les moisissures ne représentaient que dilTérentes étapes dans le développement d’une seule et même espèce.

11 se passa plusieurs années avant que l’on comprît, ce qui aujourd’hui paraît tout naturel, qu’il est absolument indispensable, dans ce genre d’études, de se li.ver exactement sur le point de départ, avant de procéder à aucune conclusion quelconque. Cette nécessité fut de plus en plus reconnue et nous verrons que l’on a réussi, dans le domaine qui nous occupe, à obtenir un degré de perfection plus élevé que dans les branches voisines de la science.

Pour l’étude des microorganismes, il sera généralement nécessaire d’employer un microscope d’un grossissement de mille fois. En ce qui concerne la levure et les moisissures, toute la préparation se réduit ordinairement à porter une goutte du liquide, dans lequel se trouvent les organismes, sur le porte-objet et de l’étendre en une couche mince au moyen du couvre-objet. S’ils ont été cultivés dans un milieu nourricier solide, on en délayera préalablement une très petite quantité dans une goutte d’eau. L’examen des bactéries doit, en tous cas, toujours commencer par cette opération. Dans l’étude moderne des bactéries et notamment dans celle des formes pathogéniques, on emploie un grand nombre de méthodes de dessiccation et de coloration, tant pour faciliter les obsei'vafons que pour donner naissance à des caractères qui, sans cela, ne pourraient être observés ([ue didlcilement, à supposer qu’ils puissent même l’ètre. A ces méthodes, on lit l’ob-

nECHI^RCHES MICROSCOPIQUES ET PHYSIOLOGIQUES. 3

jeclion sans cloute justiliée cjiie ce traitement altérait souvent chez les bactéries certaines proportions, telles ciue celles de la longueur et de l’épaisseur, par exemple. D’un autre côté, il faut appuyer sur le fait, surtout en ce c[ui concerne certaines formes pathogéniques telles que le bacille de la tuberculose, que, conformément aux observations de Koch, ce ne fut qu’une préparation de ce genre qui rendit possible la détermination certaine de ces organismes, et qu’une coloration est souvent indispensable pour découvrir les bacilles. A titre d’exemple pour les méthodes de coloration, examinons de plus près l'étude du bacille de la tuberculose, qui conduisit à une des observations les plus importantes de la médecine moderne. Koch indiqua la manière suivante : la tranche du tissu contenant les bacilles est immergée pendant 24 heures dans un mélange de 200 parties d’eau distillée, 1 partie de solution alcoolique concentrée de bleu de méthylène et de 0, 2 parties de potasse caustique en solution à 10 p. cent. Ce traitement la teint en bleu foncé et on la met ensuite pendant 15 minutes dans une solution aqueuse concentrée de vésuvine. Ensuite on la rince avec de l’eau distillée jusqu’à ce que la couleur bleue disparaisse en faisant place à une teinte plus ou moins brune; enlîn on déshydrate avec de l’alcool, on clarifie avec de l’huile de girofle, et la tranche se trouve ainsi prête pour l’examen microscopique. Les noyaux des cellules et la plupart des microcoques sont alors teints en brun, tandis que les bacilles de la tuberculose apparaissent d’un bleu intense. (De tous les bacilles connus il n’y a que celui de la lèpre qui se comporte d’une fa(;on analogue, mais il se distingue sous d’autres rapports, de celui de la tuberculose.) D’après Kocb la réaction alcaline de la solution colorante était essentielle, car ces bacilles ne se colorent jamais dans des liqueurs acides ou neutres; la solution neutre d’une autre matière colorante fait toujours dispa-

b Lies MIGUÜORGANISMES DE LA FËUMÿJTATIOX.

raiti-e la première coloration, excepté pour les bacilles de la tuberculose qui la conservent. — De toutes les méthodes proposées plus tard pour reconnaître ces microorganismes, c’est celle d’Ehrlich qui fut reconnue la plus parfaite. A la place de la potasse, il se servit de l’aniline, un liquide oléagineux, légèrement jaunâtre, qui, en solution aqueuse, a la propriété d’absorber plus de matière colorante que la potasse caustique. En outre, il employa pour la décoloration, des acides minéraux, partant de la supposition que les bacilles de la tuberculose étaient entourés d’une enveloppe ne laissant pénétrer que des liquides alcalins. Si donc les bacilles, les noyaux cellulaires, le protoplasma, etc., sont susceptibles de coloration par la solution alcaline, et si les premiers sont par conséquent difTiciles à trouver dans ce mélange, un acide détruira la couleur dans toutes les autres parties et dans tous les autres microorganismes étrangers; mais comme l’enveloppe présumée des bacilles de la tuberculose est imperméable pour des acides, ceux-ci resteront comme seuls corps colorés dans toute la préparation. Ehrlich pratique la coloration de la manière suivante: du violet de gentiane réduit en poudre fine est dissous dans une solution aqueuse d’aniline complètement saturée. On filtre 10 à 20 gouttes de cette solution dans un verre de montre, et l’on y laisse reposer la tranche à examiner pendant à peu près 24 heures, après quoi on la rince dans de l’eau distillée pour la replacer ensuite dans le verre de montre, dans un mélange de, par exemple, 3 parties d’acide nitrique et de 100 parties d’alcool. Au bout de 3 à o minutes, la tranche se trouve décolorée, on la met dans de l’alcool et enfin on l’examine dans de l’huile de girofle.

Il est connu que dans les derniers temps, l’on s’est souvent servi de reproductions photographiques de bactéries, introduites premièrement par Koch. Pour les préparer, les colorations et les décolorations sont absolument indispen-

sables, d’une part pour faire ressortir plus vivement tes contours des bactéries, d’une autre part pour éliminer tous les corps nuisibles à l’image.

La coloration et la décoloration ne sont ordinairement pas nécessaires pour l’étude physiologique de la fermentation, où les organismes sont la plupart du temps libres et rarement mêlés à des éléments gênants, et il n’y a que peu de cas où la coloration fit reconnaître des caractères spécifiques {liacterinm aceti et B. PaslenrianHiii).

Par contre, il est souvent nécessaire, dans l’étude des organismes de la fermentation et surtout dans celle des bactéries, d’appliquer un autre mode de préparation. Les sécrélions tant de nature organique que de nature inorganique, qui apparaissent dans les liquides, ont souvent une ressemblance fraj)panle avec les différentes formes de bactéries, et il est souvent extrêmement difiicile ou impossible, même pour l’observateur le plus exercé, de déterminer avec certitude si les petits corps sphériques qui se trouvent dans le champ du microscope, sont des bactéries sphériques ou des sécrétions du liquide. Dans ces cas douteux, il est convenable, avant d’entrer dans l’examen physiologique que nous décrirons plus tard, d’avoir recours aux réactifs microchimiques, qui donnent souvent des indications préliminaires très utiles. Dans la bière et en général dans les liquides nourriciers contenant des matières albumineuses, celles-ci se présentent souvent sous forme de sécrétions sphériques ou fibreuses; de même les granules d’amidon, les dextrines formées par l’amidon et enfin quelques parties intégrantes du houblon peuvent affecter la forme de petits corps sphériques. Une légère addition d’alcool, d’éther, de chloroforme, d’acide acétique, de soude, de potasse, etc., pourra donner quelques éclaircissements dans ce cas, les substances résineuses étant par exemple attaquées par les premiers, tandis que les sécrétions albumineuses le sont plus ou moins par les derniers.

8 LES MICIlOORGANISArES DE LA FERMENTATION.

L’emploi de l’iode nous fera voir les granules d’amidon comme points bleus, tandis qu’il fera apparaître certaines dextrines en rouge.

Pour les organismes supérieurs de la fermentation, les levures et les moisissures, on se sert des colorations dans un autre but, savoir, pour l'econnaiU'e quelles substances se trouvent dans la membrane ou dans la cavité cellulaire pendant les différentes phases de la croissance. Si l’on ajoute par exemple du chlorure ferrique ou un autre sel de fer à des cellules qui contiennent du tannin, celles-ci se colorent en bleu noir ou en vert. On constata de cette manière que, pendant la première période delà fermentation, les cellules du Saccharomijces cerevisiœ contenaient une quantité considérable de -tannin. En traitant des cellules de levure avec une solution d’hématoxyline ou d’acide osmique, on peut reconnaître un petit corps foncé, à contours nettement marqués, qui est un noyau cellulaire de môme nature que ceux que l’on observe sur la plupart des plantes, généralement sans préparation préalable.

2. — Études de morphologie et d'évolution à la table du microscope; chambres humides.

Une connaissance vraiment approfondie des organismes de la fermentation ne peut être obtenue que par l’étude pliijsiolofiique. Comme nous l’avons indiqué précédemment, il y a plusieurs années que l’on s’elïorça de trouver des méthodes de ce genre. Cependant l’absence totale de critique dans l’exécution des expériences les lit échouer complètement, et il s’opéra une réaction qui fut entre autres formulée dans le travail de Reess sur les Saccharomiices (1870)011 celui-ci déclare formellement n’avoir pris aucune précaution pour obtenir des cultures pures ; c’est à tel point que ces cultures étaient tombées en défaveur. Pen-

RECHERCHES MICROSCOPRjUES ET PHYSIOLOGIQUES. 9

dantlesannées suivantes, la chose prit une autre tournure, et c’est peut-être un fait unique dans l’histoire des sciences, que, dans un si court espace de temps, une nouvelle méthode de recherches se soit non-seulement frayé un chemin, mais qu’elleait conduit dans la science pathologique et dans notre branche spéciale à des résultats pratiques qui amenèrent une révolution dans plusieurs notions que l’on croyait établies d’une façon inébranlable.

L’étude physiologique des microorganismes a pour but d’approfondir la connaissance du développemenf et des phénomènes vitaux de ces êtres. Les moyens à employer consisteront évidemment à fournir aux microorganismes des conditions de développement et de multiplication telles, qu’il soit possible de suivre les transformations progressives de l’organisme et des substances qui en sont inlluencées. Tant que Ton ne désire obtenir que la connaissance des diverses formes que l’organisme en question peut affecter pendant son développement, les conditions sont faciles à produire. Mais lorsqu’on demande une culture en grand d’individus dérivant tous d’une seule cellule de l’espèce, en vue d’obtenir par des expériences phjjsiolopiques, chimiques ou purement pratiques, sur un plus grand nombre de ces organismes, des éclaircissements sur les relations qui relient leurs formes aux iniluences extérieures, ainsi que sur toute leur activité vitale, la chose devient beaucoup plus compliquée. Dans le premier cas, on n’exige qu’une culture dans laquelle l’organisme puisse se développer librement, sans s’inquiéter s’il s’y trouvent aussi d’autres individus ou espèces. Dans le dernier cas, on e.viije une culture absolument pure.

Il y a certains cas où les cultures de la première espèce fournissent des données, comme par exemple dans celui dont nous avons déjà parlé plus haut, où Ton a un liquide nourricier dans lequel des sécrétions de diverses espèces ont une ressemblance plus ou moins frappante avec cer-

10 LES MICUOOUGAMSMES DE LA FEUMENTATIOX.

laines formes de bactéries, de sorte que l’examen microscopique seul ne peut pas nous instruire exactement sur la nature de ces petits corps. Alors on aura à résoudre par l’expérience la question de savoir si ces petits corps sont susceptibles de se multiplier.

Une goutte du liquide sera portée dans une chatnl)re humide, par exemple dans celle de Ranvier (Fig. 1). Cet appareil s’obtient en pratiquant une très légère excavation au milieu d’un porte-objet ordinaire en cristal. Tout autour de cette excavation on creuse une rainure plus profonde, destinée à recevoir de l’eau. La goutte du li-^ quide nourricier, qui doit être très petite, est por- 3 tée dans le milieu du petit renfoncement et recouverte d'un couvre - objet

dépassant la rainure, et que l’on colle avec de la vaseline. La goutte se trouve ainsi étendue sous le couvre-objet dans le renfoncement du porte-objet et préservée contre

Fi(i. 1.

Eliainl)re lininide de Ranvier, a Vue d’en liant, b Vue de cùté.

l’évaporation par l’eau stérilisée qui est dans la ramure.

Une autre forme de chanibre humide est celle deBottcher (Fig. 't), que l’on obtient simplement en lixant un anneau en verre sur un porte objet ordinaire. On met quelques gouttes d’eau stérilisée à l’intérieur, et l’on suspend la gouttelette du liquide nourricier contenant les organismes au couvre-objet qui s’applique sur le bord de l’anneau de verre avec de la vaseline.

KKGHERCHES MICROSCOPIQUES ET PHYSIOLOGIQUES. Il

On place un appareil de ce genre sous le microscope et l’on observe de temps en temps les transformations des corps, ou bien on l’introduit dans un thermostat à température convenable et constante pour l’en sortir à des intervalles déterminés, afin de le soumettre à l’examen microscopique.

Ces appareils sont donc construits pour des'observations morphologiques ou botaniques à la table du microscope ; mais dès qu’il s’agit d’exécuter des recherches physiologiques, il faut que les cultures pures soient en même temps développées en culture en masse. Ce sont principalement Pasteur, Lister, Koch et Hansen qui ont développé les méthodes dans ce sens. (Voir p. 27).

La préparation de la culture pure).

Toute fermentation, soit qu’elle produise de la bière, du vin, de l’alcool, du vinaigre ou toute autre substance, dépend d’une végétation d’organismes vivants de « ferments organisés », et dans la pratique, l’industriel s’edorce d’obtenir une culture aussi pure que possible des formes les plus favorables à sa fabrication. Tout en ayant réalisé à notre époque, avec une connaissance plus approfondie des moyens et du but de ces travaux, de grands progrès, il y aura certainement toujours des limites que, pour des raisons purement pratiques, l’on ne pourra pas dépasser. Ainsi, dans la pratique, les cultures n’atteindront jamais le degré de« pureté absolue». Mais c’est un des traits les plus saillants dans l’état actuel de l’industrie de la fermentation, que l’on soit arrivé, par l’intelligence exacte de l’importance des organismes qui s’y rapportent en tant

Fig. 2.

Chambre humide de Hotteher.

a Couvre-olijet.

Couche mitrilive.

Anneau de verre.

Eau stérilisée.

12 LKS MICROORGANISMES DE LA FERMENTATIüN.

qil’agents essentiels, à travailler en vue (l’adranchir, d’une manière toujours plus parfaite, les espèces vraiment actives et utiles de l’influence des formes nuisibles. L’importance capitale de cette dernière condition ne fut reconnue que lorsque Hansen démontra, par le choix méthodique des races de levure, qu’une végétation pure permettait une fabrication plus sûre et plus uniforme cpie les levures impures et inconnues employées jusqu’alors. Nous reviendrons plus tard sur ce point, au chapitre VI.

Pour les recherches faites au laboratoire,, où il s’agit également de cultures des organismes de la fermentation, les exigences sont naturellement plus sévères ((ue poulies expériences exécutées en pratique. Ce qu’on demande ici, c’est de travailler invariablement avec dea oiltiwes absolument pures, soit sur une petite échelle, soit avec des quantités telles, que les cultures puissent, à un moment donné, quitter le laboratoire pour être introduites dans l’exploitation industrielle. On cherche à réaliser, dans un laboratoire spécialement aménagé pour ce genre d’études, les conditions qui font défaut dans l’application technique. Nous allons les indiquer brièvement ainsi que la manière de les réaliser, en commençant, pour des motifs purement historiques, par le dernier article, c’est-àdire par l’étude des récipients et des liquides destinés à recevoir la petite culture pure primitive, ainsi que les moyens employés pour l’élevage. Il est nécessaire, avant de recevoir l’ensemencerneat, que ces récipients et ces liquides soient stérilisés, c’est-à-dire rendus vierges de tout germe vivant susceptible de développement, et qu’en outre les autres appareils ainsi que l’air de la salle dans laquelle on travaille, contiennent le moins possible de germes vivants. La même remarque s’appliiiue naturellement aussi aux mains et aux vêtements de l’opérateur.