INHIBITION DE LA FERMENTATION SANS INHIBITION DE LA CROISSANCE

1. Relation entre respiration, fermentation. réaction de Pasteur-Meyerhof et croissance cellulaire.

Les chapitres précédents, ont montré que, certains dérivés halogénés arrêtent spécifiquement la fermentation, sans arrêéter la respiration. IL importe de savoir la conséquence pour la cellule de levure, de l’arrêt des phénomènes de fermentation.

D’après les notions acquises jusqu'ici en physiologie cellulaire, la cellule a besoin, pour croître, d’au moins une réaction productrice d’énergie. En l’absence d'oxygène, cette réaction est la fermentation ; en présence d’oxygène, il y a chez les levures typiques, à la fois respiration et fermentation.

Respiration et fermentation sont des phénomènes différents et par leur substrat, et par leur mécanisme. S'il est démontré, chez les anaérobies facultatifs comme la levure, que la croissance puisse se passer de la respiration, il n'avait pas été encore démontré que la croissance puisse se passer de la fermentation.

En 1925, O. MEYERHOr s’appuyant sur la définition de PaAs- TEUR, « la fermentation c’est la vie sans air », considère que dans la cellule en anaérobiose, rien n’est modifié par rapport à l2 cellule en aérobiose, sinon les réactions liées à l'oxygène libre. La fermentation anaérobie n’est nullement un phénomène pathologique, mais la suite naturelle des réactions existant déjà normalement dans la cellule aérobie. En aérobiose trois phénomènes se poursuivent simultanément

1° La fermentation des glucides qui peut être nulle si la cellule n’a pas de glucides à sa disposition, si elle se trouve par exemple dans une solution minérale ou alcoolique.

2° La respiration qui est la combustion lente d’une série diverse de molécules organiques : alcools, aldéhyde éthylique, acides acétique, lactique, pyruvique, sucres fermentescibles.

3° La réaction de Pasreur-MEYERHOF, synthèse des glucides liée à la respiration et prenant pour matériaux soit les molécules oxydées, soit les produits de la fermentation cellulaire. Dans ce cas la fermentation aérobie est diminuée d'autant. C’est vraisemblablement le méthylglyoxal qui est resynthétisé. Dans la cellule végétale comme dans la cellule animale, il représente le premier produit de dédoublement de la fermentation alcoolique ou lactique. Ce n’est pas Palcool car s’il en était ainsi, le CO? dégagé en aérobiose serait supérieur au CO? dégagé en anaérobiose et c’est l'inverse qui se passe.

La réaction de PasrEur-MEYERHOF permet à la cellule soit de levure, soit de muscle, de reconstituer son glycogène, en mi-

heu aérobie, aux dépens de diverses molécules autre que des

sucies, par exemple des lactates. MEYERHOF à montré que pour une molécule d'oxygène consommée dans la respiration,

une à deux molécules d’acide lactique, — ou de son équivalent, le méthylglyoxal, — sont retransformées en glucides.

Ce résultat est un fait d'expérience, résultant immédiatement des bilans d’analyse chimique de muscle se reposant en présence de lactate, — lactate produit par le muscle lui-même dans son travail, ou lactate apporté de l’extérieur au muscle. Le quotient du nombre des molécules d'acide lactique ou de son équivalent retransformé en glycogène, par le nombre de molécules d'oxygène, s'appelle le quotient de MEYERHOF : il a pu être mesuré, non seulement directement dans le cas du muscle, mais encore indirectement dans le cas du muscle, d’un grand nombre de cellules animales et végétales ; il a été constamment compris entre 1 et 2 ; l’exposé des principaux résultats acquis sur ce phénomène jusqu’en 1950, se trouve dans l’opuscule de L. GENEVOIS, « Métabolisme et fonction des cellules ». Depuis ce travail, la réaction de PASTEUR-MEYERHOF a été retrouvée par Marc CHAPEAU chez les Mollusques marins comme l’Huître.

Dans la conception de MEYERHOF, la fermentation continue normalement dans la cellule, même en présence d’oxygène ; ni l'oxygène, ni un peroxyde dérivé, n’agissent sur la fermenta-

paraît pas dans l'air en présence produits de la fermentation sont més avec une vitesse suf-

tion. Si la fermentation n’ap d'oxygène, c’est parce que les dans la plupart des cellules retransfor fisante pour ne pas apparaitre à l'extérieur de la cellule. Il y a donc à l’intérieur de la cellule un cycle continu de fermentation et de synthèse ; chez les cellules comme Ja IEVUTE, ie te typique, où l’intensité de fermentation est très élevée, l'in tensité respiratoire relativement faible, l'alcool qui apparait en présence d'oxygène, n’est que le résidu non transformé des produits de fermentation qui ont échappés à la réaction de PAsTEUR-MEYERHOE ; ils ont échappé parce que l’intensité respiratoire était insuffisante pour les faire entrer dans les synthèses. Ce raisonnement s'applique à toutes les cellules animales en voie de croissance, douées d’une fermentation lactique intense, et où apparaît, exactement comme chez les levures typiques, une certaine quantité d’acide lactique même en présence d'oxygène.

La fermentation est donc un phénomène continu, présenté d’une façon particulièrement intense par les cellules en voie de croissance rapide, qu’elles soient ou non dans l'oxygène. Il pouvait être tentant d'admettre que la cellule en croissance rapide trouve l’énergie qui lui est nécessaire sous une forme particulièrement utilisable dans la fermentation ; la respiration interviendrait ainsi uniquement pour débarrasser la cellule des produits de la fermentation. Si cette conception était vraie, en arrêtant la fermentation sans arrêter la respiration, on devrait arrêter la croissance : la respiration continuerait à brûler des molécules quelconques sans aucun profit pour la cellule. L'expérience a montré que cette hypothèse était inexacte : l’arrêt de la fermentation sans arrêt de la respiration, n'arrête pas la croissance ; la vitesse de multiplication des cellules reste sensiblement la même, dans un milieu saturé d'oxygène, qu’il y ait ou non un bromacétate minéral en quantité suffisante pour arréter la fermentation.

Ce résultat présente une importance assez considérable voici une cellule de levure qui vient de se multiplier pendant un grand nombre de générations au dépens de la seule fermentation alcoolique en anaérobiose : nous la plaçons brusquement en milieu aérobie en lui interdisant toute fermenta- D A

Ë se que les témoins qui fermentent dans une solution sucrée ordinaire,

Il apparaît donc que la croissance cellulaire, où les synthèses sont particulièrement rapides — la masse des cellules doublait dans les expériences en 5 à 6 heures en moyenne — est possible tout aussi bien aux dépens de la fermentation qu'aux dépens de la respiration : ces deux réactions productrices d'énergie n’interviendraient done pas par leur mécanisme chimique ; la seule chose qui intéresse la cellule est l’énergie fournie par ces réactions ; tout se passe comme si la croissance cellulaire était une chaudière de machine à vapeur : la machine à vapeur fonctionne également bien, que la chaudière soit chauffée par du charbon, du mazout, ou par des résistances électriques, pourvu que la quantité d’énergic fournie par unité de temps soit. la même. Il est un peu inattendu de trouver dans les cellules une pareille facullé d'adaptation ; il apparaît pourtant, d’après les recherches les plus récentes qu'il s’agit ici réellement d'une propriété tout à fait générale de la cellule. Cette conception vient d’être développée par L. GENEvOIS dans un article récent (Biologie médicale 1933), à propos des recherches de H. A. KREBS qui a montré que la synthèse de l’urée par les cellules du foie se fait sans intervention directe de la respiration, mais qu’elle est liée à la grandeur de l'intensité respiratoire. J. BRISOU (1933), a montré que l’on peut de même arrêter chez les animaux adultes la fermentation lactique des tissus sans aucun trouble ; on peut donc généraliser à la cellule animale. Enfin une expérience de HaAurowITZ, (1927) complète la symétrie de la démonstration : de jeunes souris blanches, venant de naître, peuvent supporter sans inconvénient, une anaérobiose de plusieurs heures. La cellule animale jeune, ayant une intensité de fermentation lactique élevée, est donc une cellule anaérobie facultative, exactement comme la cellule de levure. La même démonstration avait été donnée par Winp et NEGELEIN pour la cellule cancéreuse. (OTTo WARBURG, « Métabolisme cellulaire et métabolisme des tumeurs »).

L'arrêt de la fermentation laisse intactes, respiration et croissance cellulaire ; la réaction ‘de PASTEUR-MEYERHOF subsiste également intacte ; si l’on substitue aux sucres des lactates comme aliment énergétique pour la cellule de levure, la croissance continue à se poursuivre normalement ; il est possible d’en déduire sans trop d’arbitraire que la cellule continue à pouvoir faire du glycogène aux dépens des lactates, le lactate représentant une forme de stabilisation du mé-

TS

thylglyoxal, de valeur énergétique moindre que ce dernier corps, il est raisonnable de penser que le méthylglyoxal luimême serait retransformé en glycogène en présence d’un inhibiteur de la fermentation. En d’autres termes, l’inhibition de la fermentation par les acides halogénés laisse substituer la réaction de Pasreur-MEYERHOFr, la synthèse en glucides des lactates tout au moins.

2, Observation vitale.

Avant de faire des mesures quantitatives de croissance il était nécessaire de s’orienter sur la nature du phénomène en utilisant la méthode de coloration vitale. Grâce à elle nous pouvons voir très rapidement si une cellule est bien vivante, si le corps étudié ne se comporte pas comme un corps toxique si la culture n’est pas contaminée par une bactérie aérobie, si enfin, au cours de la croissance nous retrouvions bien ja cellule avec laquelle nous avions ensemencé le milieu et non un micoderme ou une levure non typique. Les colorants dits vitaux (bleu de méthylène, de crésyle, de Nil, rouge neutre) ont la propriété de pénétrer dans la cellule vivante et de colorer certaines enclaves du protoplasma. Cest PFEFFER, en 1886, qui a le premier remarqué que les vacuoles accumulent le bleu de méthylène, et prennent rapidement une coloration beaucoup plus intense que celle de la solution même, teinte qui disparait lorsqu'on replace la cellule dans l’eau pure. Cette teinte est due à la coloration des granulations du cytoplasme et non à celle du cytoplasme lui-même.

Les recherches de GUILLIERMOND, ont démontré que la coloration des vacuoles est essentiellement vitale. La mort des cellules de levure devient un phénomène bien visible. Elle s'annonce par une coloration diffuse du protoplasme, puis par la decoloration et la contraction de la vacuole, la désorganisation de sa paroi ; à ce, moment le protoplasme entier prend une teinte rouge foncé. GUILLIERMOND a cultivé les champignons les plus variés (Mucorinées, Oïdium lactis, Pénicillium glaucum, levure) sur une concentration de 2 mg. p. 100 de rouge rentre, les cultures ne différent pas des cultures témoins et pendant tout leur développement présentent une superbe coloration des vacuoles. Au-dessus de 5 mg. p. 100 le développement se ralentit, mais les Champignons conti-

nuent à vivre jusqu’à 50 ou 60 mg. p. 100. Le bleu de Nil est beaucoup plus toxique, le bleu de méthylène l’est moins, mais c’est le rouge neutre qui présente la plus grande inocuité.

AUBEL, AUBERTIN et GENEVOIS ont démontré que les cellules de ievure vivent dans des milieux additionnés de rouge neutre et alcalins, conditions dans lesquelles leurs vacuoles sont colorées ; l'intensité de respiration n’est pas augmentée par ces colorants. GENEVOIS étudiant ce phénomène sur les cellules d’Algues Protococcacées trouve une augmentation d'intensité sespiratoire par les colorants vitaux de rH supérieur à 8 (bleu de méthylène) de nature catalytique, et liée à l’accumulation du colorant à l’intérieur de la cellule.

Au cours des expériences décrites dans les chapitres précédents, il était facile, par la méthode des colorations vitales pratiquée à la fin de l’opération sur les témoins et sur les lots de cellules traitées, de se rendre compte des modifications morphologiques subies par les cellules traitées. A la fin de l'opération quelques gouttes de suspension de levure étaient mélangées d’une solution de phosphate disodique (pH 8) N/10 ; puis après mélange on ajoutait deux gouttes de rouge neutre à 4 0/00 ; si immédiatement après le mélange on observe les cellules, la coloration est d’abord douteuse ou indistincte ; puis, dans les 20 minutes qui suivent l’opération, on voit que des granulations rouges apparaissent dans la plupart des cellules, signe de l'intégrité de la structure de la cellule ; si la cellule prend dans son entier une coloration rouge ou vrange, on peut la considérer comme morte ; si en effet, on mesure les constantes du métabolisme de cellules ainsi colorées, on trouve qu'’elies sont pratiquement nulles, au moins pour la respiration. Le parailélisme entre l'observation morphologique et l'observation physiologique s’est révélé jusqu'ici assez bon. Toutefois. on pourrait évidemment imaginer des substances capables d’arrêter la fermentation et la respiration sans tuer les levures : un mélange de KCN d’acide bromacétique serait dans ce cas. C’est pourquoi il faut faire à l'observation morphologique la restriction suivante : si les cellules paraissent entièrement colorées, c’est qu’elles sont grossièrement altérées, et ont perdu toutes les propriétés de la vie ; si elles présentent la coloration vitale, elles doivent posséder, au moins en puissance, encore certaines des propriétés de la vie.

L'étude des cellules, après l’action des dérivés bromés soit

en aérobiose, soit en anaérobiose, a toujours montré des proportions de cellules vivantes du même ordre dans les récipients traitées et les récipients témoins ; tout cela, dans le cas des acides halogénés seuls, et des cétones halogénées. Les méanges d’acide bromacétique et de cystéine, les esters d'acide halogénés, sont au contraire très toxiques : après une action de quelques heures en milieu étendu (N/4000) la plupart des celiules apparaissent comme tuées.

La non nocivité des dérivés bromés est apparue même au cours d'expériences de longue durée, où les cellules étaient conservées plusieurs jours au contact des acides halogénés. joutefois, si les cellules sont en anaérobiose, une altération

apparaît d’une façon sensible.

3. Culture des levures en fioles d’Erlenmeyer. Irréversibilité de l'arrêt de la fermentation après culture | sur l’acide bromacétique.

Les premières expériences ont été faites en semi aérobiose dans les fioles d'ERLENMEYER contenant 50 cm° de liquide, représentant une épaisseur d’un centimètre. £

Le milieu contenait de l'acide acétique N/2 neutralisé à moitié et la solution phosphatée magnésienne, l'acide bromacétique était à la concentration de N/5000. Au bout de 5 jours, la levure était pesée dans les différents récipients. Trois milieux différents ont été préparés l’un à l’acétate seul, l’autre au saccharose, un troisième à l’alcool. Le milieu saccharosé était à 2 p. 100, le milieu à l'alcool contenait 23 g. par litre. Après 5 jours la croissance sur acétate était faible, sur alcool encore plus faible, sur saccharose seulement on notait un beau développement ; au microscope l'aspect des cellules sur acétate montrait 95 p. 100 des cellules vivantes, tandis que les cellules sur alcool étaient presque toutes tuées. En milieu saccharosé les cellules étaient bien entendu très vivantes et en pleine multiplication. En présence d’acide bromacétique la fermentation était Los dans ces différents milieux, elle l'était encore, même après deux centrifugations. Ces : ; cées alors dans “ milieu glucosé US ra bées, le phénomène a RE ici irréversi Te N

ÉNQNE Ë AC versible ; ces levures totalement inhibées furent alors placées dans une solution de

bleü de méthylène qui fut rédui i éduit avec une ) À qui ft it avec une vitesse égale à celle

des levures témoins et en gardait leur intensité de fermentation. Le tableau XXXIII donne les développements de levure.