Chapitre IL — Gentiana asclepiadea L., racines et tiges foliées

— 111. — c/’Mci«to L., racines et tiges

foliées.

— IV. — Gentiana Pneumonanthe L., racines et tiges foliées.

— V. — Gentiana punctata L., racines et graines.

— VL — Gentianagermanica'WiWà.^Taemes ei tiges foliées.

— Vil. — Gentiana purpiirea L,, racines.

— Vlll. — Gentiana acaulis L., plante entière.

Au cours de mes recherches sur cette dernière Gentiane, j’ai découvert un glucoside nouveau, la gentiacauline, dont on trouvera l’étude à la fin de ce chapitre.

Le Chapitre IX est réservé à trois petites Gentianes : Gentiana nivalish., Gentiana campestris h., Gentiana tenella Rottbel.

Enfin, deux tableaux résument les résultats de ces essais.

La Deuxième Partie est divisée en deux chapitres, dont le premier comporte l’étude du Chlora perfoliata L., racines et tiges foliées, et le second celle du Swertia perennis L., tiges foliées.

La Troisième Partie renferme deux chapitres dont le premier est réservé au Menyanthes trifoliata L.

On trouvera d’abord l’exposé des recherches qui ont été faites antérieurement sur le Trèfle d’eau et des essais biochimiques effectués sur la plante entière, sur les feuilles et sur les rhizômes séparément. Vient, ensuite, l’étude de la méliatine, glucoside nouveau que j’ai découvert dans le Trèfle d’eau.

Dans le Chapitre II, on traitera du Limnanthemum Nymphoides Hoffms. et Link.

La Quatrième Partie est divisée en deux chapitres.

J'ai choisi, pour étudier les variations dans la composition au cours de la végétation, deux Gentianées que j’ai analysées dans ce travail et qui ne renferment pas le même glucoside.

Dans le Chapitre Premier, on trouvera l’étude de la racine de Gentiana lutea L., et, dans le Chapitre II,celle du Menyanthes trifoliata L., plante entière.

Enfin, un dernier chapitre est réservé aux conclusions.

Dans tous les essais biochimiques effectués au cours de ce travail, j’ai eu recours, pour doser le sucre réducteur, à un procédé de dosage indirect dont le principe a été donné par Mohb, en 1873. En 1906, M. G. Bertrand (1) a précisé les détails techniques de cette méthode et publié des tables indiquant, de milligramme en milligramme les quantités des principaux sucres réducteurs correspondant aux poids

(1) G. Bertrand.— Le dosage des sucres réducteurs. Œnll. Soc. Chim (3), XXXV, p. 1287, 1906). '’

de cuivre trouvés. En suivant exactement la technique de M. G. Bertrand, cette méthode donne des résultats d’une grande précision, et n'est d’ailleurs guère plus longue que le procédé ordinaire à la liqueur de Fehling.

Tout mon travail a été accompli dans le laboratoire de M. le Professeur Bourquelot et sur ses conseils. C’est aux côtés de ce Maître bienveillant que, grâce à ses encouragements qui ne me firent jamais défaut un seul instant, j’ai pris le goût des recherches scientifiques. Qu’il veuille bien permettre à son élève de lui exprimer ici sa respectueuse reconnaissance et son profond attachement.

Je dois remercier aussi M. le Professeur agrégé Hérissey, dont j’ai pu apprécier bien souvent les conseils sûrs et éclairés, et mon ami H. Leroux, pharmacien des hôpitaux, qui m’a initié au maniement de son appareil électrique de combustion, appareil à la fois si rapide et si précis.

Je suis heureux de pouvoir adresser mes meilleurs remerciements à mes excellents confrères, M. Dufour, de Gérardmer, et M. Disdier, de Grenoble, pour les plantes qu’ils ont bien voulu m’adresser avec tant d’empressement, et Mademoiselle A. Fichtenholz, pour l’aide qu’elle m’a toujours apporté si amicalement dans les traductions nécessaires à toute recherche bibliographique.

Je regarde enfin comme un devoir bien doux d’exprimer, ici, à mon père, tout mon amour filial, car j’ai mis bien souvent à contribution, sans compter, sa connaissance approfondie de la flore du Loir-et-Cher et de l’Indre-et- Loire. G’est grâce à lui que j’ai pu trouver, notamment, une station importante de Trèfle d’eau, où j’ai récolté près de cent kilogrammes de cette plante, qu’il a été possible de traiter vingt-quatre heures à peine après leur récolte.

LA MÉTHODE BIOCHIMIQUE.

Parmi les ferments solubles hydratants, les uns n’exercent leur action que sur un seul composé, les autres, au contraire, agissent sur un nombre plus ou moins grand de principes immédiats, mais qui sont tous reliés par des propriétés communes assez étroites. En un mot, chaque ferment soluble hydratant est spécifique d’un composé ou d’une série de composés.

La méthode biochimique de recherche des sucres et des glucosides s’appuie précisément sur cette propriété spécifique qui permet de reconnaître un principe immédiat ou une classe de principes immédiats par l’action hydrolysante d’un ferment bien déterminé (1). Elle utilise deux ferments, Vinvertine, ferment spécifique du saccharose libre ou combiné, et Yémulsine, ferment spécifique d’un certain nombre de glucosides renfermant tous dans leur molécule le glucose-d.

L’invertine est un ferment qu’on peut obtenir, sous forme de poudre, sans mélange d'autres ferments, en tuant, par l’alcool fort, la levure des boulangers ou levure haute, fraîche, suivant le procédé indiqué par M. Bour- QUELOT ( 2 ).

(1) Ena. Boürquelot. — Recherche, dans les végétaux, du sucre de canne à l’aide de l’invertine et des glucosides à i’alde de l’émulsine. [C.R. Acad, des Sciences. CXXXIII, p. 690, 1901). (Journ. dePharm. et de Chim., (6), XIV, p.481, 1901).

Etn. Boürqublot. — Sur la recherche, dans les végétaux, des glucosides hydrolysables par l’émulsine. [.Journ. de Pharm. et de Chim. (6) XXIII, p. 369, 1906).

(2) Em. Boürqublot. — Sur l’emploi des enzymes comme réactifs dans les laboratoires. II—hydratases. [Journ. de Pharm. et de Chim., (6), XXV, p. 16, p. 378, 1907).

Le choix de la levure n’est pas sans importance. E. Fischer a montré que la levure séchée à l’air possède la propriété de dédoubler l’amygdaline en.glucose-d et en amygdonitrileglucoside ; elle renferme, dans ce cas, le ferment que l’on désigne sous le nom d.'amygdalase. Si on emploie dans la préparation de l’invertine une levure vieille d’une semaine ou plus, cette levure renfermera des traces d’amygdalase qui pourront troubler les résultats dans le cas de l’essai d’une plante renfermant saccharose et amygdaline.

11 faut donc avoir recours à de la levure bien fraîche qui donnera une invertine inactive sur l’amygdaline (1).

L’émulsine, préparée, avec des amandes douces, d’après le procédé donné par M. Hérissey (2), est un mélange de plusieurs ferments, dans lequel se trouve en proportion plus grande que les autres l’émulsine proprement dite, c’est-à-dire le ferment qui hydrolyse les glucosides. On y a signalé, en outre, la lactase, la gentiobiase (3), la mélibiase et la manninotriase (4), ferments hydrolysant respectivement le lactose, le gentiobiose, le mélibiose, le manninotriose.

Pour employer ces deux ferments, invertine et émulsine, il faut les faire agir successivement sur un extrait liquide, aqueux, préparé de la façon suivante :

La plante à essayer doit être traitée fraîche, la dessiccation pouvant modifier sa composition. On divise grossièrement deux à trois cents grammes du végétal et l’on fait tomber les fragments au fur et à mesure dans de

(1) Em. Boürqüelot et H. Hérissey. — Du choix de la levure dans l’application des procédés biochimiques à la recherche des sucres et des glucosides. {Journ. de Pharm. et de Chim., (7), VI, p. 246, 1912).

(2) H. Hérissey. — Recherches sur l’émulsine. {Thèse Doct. Univ. (Pharmacie), Paris 1899).

(3) Em. Bourquelot et H. Hérissey.— 0’. R. Soc. de Biologie, p. 213,1903.

(4) J. ViNTiLESCO. — Etude de l’action des ferments sur le stachyose {Journ. de Pharm. et de Chim.,{&), XXX, p. 167, 1909).

l’alcool, à 90“ bouillant qu’on a additionné, au préalable, d’une petite quantité de carbonate de calcium. L’emploi de l’alcool bouillant a pour but de tuer les ferments qui existent dans les végétaux et qui pourraient, sans cette précaution, bydrolyser ultérieurement les sucres et les glucosides. C’est dans un alcool de titre voisin de 60“ que cette destruction se fait le mieux (1), et on arrive ici précisément à ce titre, l’eau contenue dans les tissus végétaux diluant l’alcool à 90'.

L addition de carbonate de calcium est nécessaire pour saturer les acides organiques qui pourraient amener le dédoublement de certains principes glucosidiques ou sucrés.

En faisant tomber les fragments dans l’alcool bouillant, on a soin de ne pas interrompre l’ébullition du liquide. Quand cette opération est terminée, on relie le ballon à un réfrigérant à reflux et on continue l’ébullition pendant 20 minutes. On laisse alors refroidir ; après refroidissement, on broie la plante et on lui fait subir un deuxième traitement à l’alcool bouillant, de façon à l’épuiser complètement.

On exprime à la presse, on filtre et on distille l’alcool au bain-marie.

Le résidu aqueux est filtré après refroidissement, et distillé à sec, sous pression réduite. On reprend l’extrait, à chaud, par de l’eau thymolée, on laisse refroidir et on filtre. On complète alors le volume avec de l’eau thymolée de façon que 100 cm^ de liquide obtenu correspondent a 100 grammes du végétal èssayé.

On défèque .20 cm^ du liquide au sous-acétate de plomb ;

(1) Em. Bourquelot et M. Bridel. — Sur la température de destraction de l’éraulsine dans des alcools deldifférenls titres, (/oar/i. de P/iarm. et de Chim., {l),\U, p. 27, 1913).

■ Sur la résistance, à l’aclion do,1a chaleur, de l’émulsine en conlact avec les.alcools forls. (/6id.., (7), VII, p. 65, 1:913).

on en fait l’examen polarimétrique et on y dose le sucre réducteur.

Au reste du liquide, on ajoute de l’invertine dans la proportion de 0 gr.,50 pour 100 cm^ et on porte à l’étuve à -f- SO^-SS®. On fait tous les jours, après défécation de 20 cm^ au sous-acétate de plomb, l'examen polarimétrique et le dosage du sucre réducteur. Quand on a obtenu, deux jours de suite, les mêmes chiffres, ce qui arrive généralement en 3 ou 4 jours, l’action du ferment est terminée.

La plante contient-elle du saccharose ou un autre sucre renfermant du lévulose uni au glucose, on constate un recul de la déviation vers la gauche et une augmentation de sucre réducteur.

Si le sucre hydrolysé est du saccharose, les changements optiques observés coïncident avec ceux qu’indique, le calcul en considérant le sucre réducteur formé comme étant du sucre interverti.

On peut encore reconnaître si le sucre hydrolysé est du saccharose de la façon suivante :

Avec le recul de la déviation observé sous l’action de l’invertine et le sucre réducteur formé, on calcule à combien de sucre réducteur pour 100 cm^ correspond un recul de 1“ (1 = 2). C’est Vindice de réduction enzymolytique, préconisé par M. Bourquelot pour la diagnose des glucosides, comme on le verra tout à l’heure. L’indice de réduction du saccharose étant 603, si on trouve par le calcul un chiffre voisin de cette valeur, c’est que le sucre hydrolysé est vraisemblablement du saccharose.

Après avoir ainsi constaté que l’action de l’invertine est terminée, on porte le liquide au bain-marie bouillant, en vase clos, pendant 20 minutes, afin de détruire l’invertine. On retire alors le flacon du bain-marie, et on ajoute, après refroidissement, de l’émulsine dans la proportion de 0 gr.,25 pour 100 cm-* ; on replace le flacon à l’étuve.

Les jours suivants, on renouvelle, après défécation

préalable, l’examen du liquide au polarimètre et le dosage du sucre réducteur. Si on constate un retour de la déviation vers la droite, en même temps qu’une augmentation de sucre réducteur, on peut conclure à la présence d’un glucoside lévogyre dérivé du glucose-d. Ce retour est généralement rapide, et l’action de l'émulsine est terminée en 5 ou 6 jours. Cependant, elle peut être retardée pour diverses causes, et j’ai vu des essais à l’émulsine se prolonger pendant près de deux mois ; dans ce cas, il faut alors ajouter de temps en temps 0 gr. ,25 d’émulsine au liquide.

Si la plante essayée contient un sucre comme le raffinose, le stachyose, le verbascose, qui renferment du saccharose combiné et ont été, à cause de cela, partiellement hydrolysés par l’invertine, on constate, sous l’action de l’émulsine, un recul de la déviation vers la gauche au lieu d’un retour vers la droite. Ce recul est dû à l’hydrolyse des polysaccharides nouveaux mis en liberté par l’invertine : mélibiose, etc..., hydrolyse produite par les ferments spéciaux que l’on rencontre dans l’émulsine des amandes.

Si la plante contient en même temps qu’un de ces sucres un glucoside dédoublable par l’émulsine, le sucre n’étant hydrolysé que très lentement, on constate d’abord un retour de la déviation vers la droite (hydrolyse du glucoside), puis un recul de la déviation vers la gauche (hydrolyse du sucre). On conçoit même que, dans certains cas, le recul et le retour puissent arriver à se compenser : alors, on ne constatera pas de changement de déviation, tandis qu’il y aura augmentation de sucre réducteur. Nous avons rencontré ce cas tout à fait spécial, M. Bourquelot etmoi, en étudiant la graine à'Entada scandens Benth.(l).

(1) Em. Bourquelot et M. Bridel. — Sur la recherche du raflînose dans les végétaux. Sa présence dans deux graines de Légumineuses : Erythrina fusca Lour. et Entada scandens Benth. [Journ. de Pharm. et de Chim.,{6),XXX, p. 162, 1909).

M. J. ViNTiLKSco, en essayant le Jasminum officinale L., qui renferme un glucoside et du stachyose, a constaté, après une action de vingt-quatre heures un retour de 1“7’, et, dans les 10 jours suivants, un recul de 1» (1).

Mais, dans la plupart des cas, le glucoside existe dans les plantes sans être accompagné d’un de ces sucres dont la présence complique le problème.

Quand le glucoside est seul,on a d’utiles indications en établissant le rapport qui existe entre le retour de la déviation vers la droite et la quantité de sucre formé. C’est ce rapport que M. Bourquelot appelle indice de réduction enzyniolytique. L’indice de réduction enzymolytique est le nombre de milligrammes de sucre réducteur formé, dans 100 cm'* de liquide, pour un retour de la déviation vei's la droite de 1", retour observé au tube de 2 décimètres (2).

Cet indice de réduction enzymolytique est une constante caractéristique pour chaque glucoside et permet de reconnaître si on est, dans une plante, en présence d’un glucoside connu ou si ce glucoside y est seul.

Telle est, dans ses grandes lignes, la méthode biochimique à l’invertine et àTémulsine.

Cependant, on a constaté que, quelquefois, l’action de l’émulsine était empêchée par la grande proportion de matières tanniques que renferment certaines plantes, entre autres la plupart des Ericacées. On est averti de la présence du tanin en trop forte proportion par le précipité que l’on obtient en déféquant l’essai au sous-acétate de plomb. Dans ce cqs, on ne peut opérer dans les conditions décrites

(1) J. ViNTiLESCO. — Recherches hiochimiques sur quelques sucres et glucosides. {Thèse Doct. Sciences), p. 29, 30, Paris 1910).

(2) Em. Bourquelot.— Nouvelle contribution à la méthode biochimique de recherche, dans les végétaux, des glucosides hvdrolysables par l’émulsine : son application à l’étude des plantes employées en médecine populaire. {Journ. de Pharm. et de Chim., (7), II, p. 241, 1910).

ci-dessus. Il faut, avant de faire agir les ferments, avoir recours à une défécation partielle du liquide au sous-acétate de plomb. On filtre ensuite, on élimine le plomb par l’hydrogène sulfuré,'puis l’acide acétique par distillation, sous pression réduite, sans dépasser la température de 40“. Les conditions opératoires de cette modification à l’application de la méthode ont été étudiées dans tous les détails par Mlle A. Fichtenholz au cours de ses travaux sur la recherche des arbutines dans les végétaux (1).

Instituée en 1901, la méthode biochimique a été le point de départ d’un grand nombre de recherches dont nous allons examiner les résultats. Nous nous occuperons d’abord des liydratesde carbone hydrolysables par l’invertine, puis des glucosides hydrolysables par l’émulsine.