TL ACCOUTUMANCE DES LEVURES AU GALACTOSE
Nous venons dans le chapitre précédent de reconnaitre l’influence possible de l’origine de la semence sur la décomposition du galactose en alcool et en acide carbonique.
D’autres expériences nous permettent de constater le même fait. Je citerai par exemple celle-ci : J’ensemence dans du liquide Laurent additionné de 0,5 0/0 de peptone et de 4 0/0 de galactose une levure depuis 1 mois développée dans un matras Pasteur. Si ce dernier avait renfermé préalablement du glucose, la levure ne se développe pas dans le liquide Laurent. Si au lieu de glucose le matras avait renfermé du galactose, la levure se développe très bien.
Avec une levure jeune, l'influence de l’origine de la semence est nulle.
Pour mieux nous rendre compte de cette influence qui se
manifeste dans des conditions spéciales, changeons notre manière d'opérer et plaçons la levure de facon à réduire au minimum sa multiplication pendant la durée de nos essais. Si une levure cultivée dans un même milieu mais en présence de différents sucres possède des propriétés différentes, celles-ci demeureront tant que les levures ne se multiplieront pas et il sera facile de les mettre en évidence.
Or, pour rendre minima la multiplication, nous avons opéré de la manière suivante :
Pasteur et ensuite Brown ont constaté qu’en introduisant des quantités croissantes de levures dans un milieu nutritif sucré il arrivait un moment où la levure iniroduite ne variait plus de poids pendant la fermentation. En augmentant encore la quantité de celle-ci, on oblenait une diminution dans le poids des cellules et, exarninée au microscope, une telle levure bourgeonnait très peu. Si donc on force la dose de levure, on réduit sa multiplication en la rendant sensiblement nulle, Je me suis placé dans ces conditions en opérant de la manière suivante : Dans 100 c. c. d'un milieu nutritif donné on cultive une levure pure. En employant le procédé décrit au chapitre I on décante la levure et on la place dans des tubes. On obtient de cette façon dans chaque tube de 04,100 à 0,130 de levure en masse. En faisant agir cette levure en masse sur 5 ce. c. d’une solution de glucose ou de galactose, nous faisons une fermentation avec 20 fois plus de levure qu'il ne s’en serait développé si on avait ensemencé ce volume de liquide avec une trace de levure. Je suis donc dans le cas indiqué plus haut. J'appellerar pour abréger levure habituée à un sucre donné, une levure obtenue en la cultivant dans l’eau de touraillons additionnée du sucre considéré.
Expérience 1. — Prenons un certain nombre de tubes renfermant de la levure en masse habituée soit au glucose soit au galactose. Dans chacun j'introduis 5 €. c. d’une solution de galactose à 60/0. On les place à l’étuve à 25° et on note le moment où on peut compter 1 bulle gazeuse par seconde. Ce moment es considéré comme le commencement de la fermentation. Tous les tubes renfermant la levure habituée au galactose fermentent au bout de 2 heures. Ceux qui renferment la levure habituée au glucose restent pendant 24 heures et souvent plus longtemps sans
Eesonus manifester la moindre fermentation. Je laisse de côté en ce moment les levures de lactose sur lesquelles nous allons bientôt revenir. La même expérience répétée en remplaçant la solution de galactose par 5 c. c. d'une solution de glucose ne permet pas de différencier les levures accoutumées ou non au galactose.
Donc en réduisant, comme nous le faisons, la multiplication, nous constatons une très grande différence entre le moment où la fermentation du galactose commence dans les tubes renfermant des levures habituées à ce sucre et dans ceux renfermant des levures habituées au glucose. Une fois la fermentation du galactose commencée par ces dernières, elle marche aussi vite qu'avec les levures habituées au galactose. Il faut donc penser qu'un travail intérieur a dû se faire pendant la période d'inactivité de la levure. Sur la nature de cetravail nous ne pouvons nous étendre pour le moment.
Nous constatons et retenons pour l'instant que naturellement les levures sont accoutumées au glucose, tandis qu’elles ne le sont pas au galactose, sucre plus rare ou mieux moins répandu à l’état libre. Je dis moins répandu à l’état libre, car de nombreuses expériences, entre autres les récentes recherches de M. G Bertrand, nous apprennent que chez les plantes on trouve du galactane qui par hydrolyse donne du galactose,
Nous avons rejeté pour le moment les levures de lactose. C’est que ceiles-ci, habituées au glucose, manilestent une certaine h'bitude au galactose. Ainsi au bout de 2 heures, chez certaines de ces levures habituées au glucose, on obtient un commencement de fermentation du galactose, mais il faut ajouter qu’habituées au galaciose ou au lactose ces levures manifestent une activité vis-à-vis du gilactose presque inconnue chez les autres. Voici en effet quelques nombres.
Levure lactose. Origine. La fermentation commence après Saccharose, 24 heures.
Duczaux. Galactose. 1 heure, Kavser. Saccharose. 2 heures.
Galactose, 1 heure, Laclose. 30 minutes.
L'acclimatation est donc encore ici manifeste. Elle est plus sensible encore quand on habitue les levures au lactose.
Exprrience II. — Les résultats de la première expérience se rapportent à des levures habituées au glucose ou au galactose.
no D
Voyons l’action des autres sucres (levulose, saccharose, maltose, mélibiose, lactose).
Dans des tubes renfermant une levure en mass habituée à l’un ou l’autre de ces sucres, nousintroduisous3 c. c. d’une solution de galactose Si nous désign ons par 7m le temps mort pendant lequel toute fermentation semble nulle dans les tubes. nous obtenons les résultats suivants avec deux levures :
Origine. JET \ Sac-harose. 2 heures.
levure de lactose. \ Galactose, 1 heure, Lactose. ls heure:
Maltose, 2 heures.
Glucose. 2 jours.
\ Saccharose. 2 jours:
Levure de Frohberg. Levulose, JA jours.
| l Mélibiose. { heure.
\ Galactose, À heure.
Le saccharose, le glucose, le levulose, le maltose, c'està-dire tous les sucres qui ne peuvent par hydrolyse donner du galictose donnent des levures qui manifestent un temps mort considérable quand en masse on les met en présence de galactose. Au contraire le lactose et Le mélibiose, sucres qui, sous l’action des acides ou de diastases, la lactase ou la mélibiase, donnent du glucose et du galactose, sont les seuls avec le galactose capables d’acclimater les levures à ce sucre,
Les mêmes levures habiluées à ces différents sucres, mais qui reçoivent du glucose en place de galactose, ne manifestent aucun temps mortcomme précédemment avec le galactose, l'activité élant sensiblement læmême quel que soit le sucre auquel la levure tire son o ivine.
Je dis sen-iblement la même, car si on prend une levure habitnée au glucose et au levulose par exemple, et qu'on là fasse agir sur une solution de glucose, on constate chez la première une activité légèrement supérieure. Avec ces nièmes levures mais mises en présence d’une solution de levulose, Pordre est inverse, cependant ces différences sont si faibles que dans notre travail nous les négligerons.
En résumé, toute levure faisant fermenter le galactose à dû s’habituer préalablement à ce sucre. Cette condition n’est pas nécessaire pour le glucose, Cette différence est très importante.
Expérience 111. — De facon à bien montrer les conditions
nécessaires pour constater cette différence entre les levures habituées au galactose et celles qui ne le sont pas, modifions un peu le dispositif de l'expérience [. Prenons trois ballons aplatis comme l'indique la figure.
En a est un tube fermé à sa partie inférieure.
Dans chacun de ces ballons nous introduisons 400c. c. d’eau de touraillons additionnée dans l’un de glucose, dans un second de maltose et dans le troisième de galactose. On ensemence et, une fois la levure développée, on soutire le liquide en faisant en sorte que la levure reste au fond du ballon. Celle-ci est lavée et on s'arrange de façon que toute la levure reste dans le petit tube a. L'eau de lavage est remplacée par- une solution de galactose. 24 heures après, on analyse chaque ballon et on trouve :
Sucre fermenté 9/0
Ballon renfermant eau de touraillons glucose. ................ 3,80 — — MATOS er Pre nee 3,10 = — CAlACIOS CE ET 4,02
La levure en masse a pu se multiplier sur le fond du ballon et a permis aux cellules de s’accoutumer rapidement au galactose au point de rendre nulle l'influence de leur origine.
Rapport entre l’activité de la fermentation du glucose et celle du galactose. — Si on fait agir une levure habituée au galactose sur une solution de glucose ou une solution de galactose, on constate qu’il existe un rapport entre la quantité de glucose décomposé et la quantité de galactose fermenté par un poids donné de levure au bout de 24 heures.
Également pour abréger nous désignerons ce rapport par R.
Voici quelques valeurs trouvées pour R avec différentes
levures.
Levure Poids de levure Valeur de R,.
en milligr.
Levure Bass. 108 1,6 Levure distillerie Alfort, 91 1.65 Levure de vin N° 6 85 1,5
Pour toutes ces levures on voit que les valeurs de R sont sensiblement constantes. J'ai trouvé des résultats semblables pour d’autres levures. Ceci signifie que chez les levures habi-
CRT
one
tuées au galactose ce sucre fermente 1,6 fois moins vite que le glucose. Chez les levures habituées au glucose la valeur de R au bout de 24 heures est généralement égale à +. À mesure que la levure s’acclimate, ce rapport diminue.
MM. Buchner et Rapp, opérant avec la zymase alcoolique qu'ils retirèrent de levures non acclimatées, ont trouvé les quantités suivantes de CO? dégagé en présence de 1 0/0 de toluène.
Co? dégagé après
TR Sucre. Concentration. 16 heures. 24 heures. 40 heures. Glucose 3/0 0,40 0,61 0,70 Galactose 8/0 0,08 0,11 0,12 Valeur de R. ù 539 5,8
Les valeurs de R qu'on tire des résultats de MM. Buchner el Rapp sont plus élevées que celles tirées de nos expériences.
Cette valeur de R — 1,6 nous sera utile dans un chapitre prochain pour nous rendre compte du degré d'accoutumance des levures au galactose. La valeur de R pour les levures de lactose habituées au glucose est égale à 4 ou 5 après 24 heures. Nous dirons que ces levures sont en partie accoutumées au galactose.
Durée de l'acclimatation. — L'accoutumance une fois établie chez une cellule persiste-t-elle et dans quelles conditions persiste-t-elle?
Ce problème posé, pour le résoudre on peut prendre une série de tubes renfermant de la levure en masse habituée soit 4, glucose soit au galactose. Je désignerai par des numéros impairs 1 et 3 les tubes renfermant les levures habituées au premier sucre et par des numéros pairs 2 et 4 ceux renfermant les levures habituées au galactose.
Ceci fait, j'ajoute #c. c. d'une solution de glucose à 31 0/0 dans les tubes Let 2 et 4c.c. d’une solution de galactose à 10,91 0/0 dans les tubes 3 et 4.
Le temps mort est de { heure dans les tubes 7, 2 et 4, il est de 24 heures dans le tube 5.
Au bout de 5 jours la fermentation est terminée, sauf dans le tube 3 où tout dégagement gazeux cesse seulement au bout de 10 jours. Aussitôt la fermentation achevée dans un tube, on soutire le liquide fermenté, on lave la levure à l’eau distillée et on y introduit une nouvelle solution sucrée.
Les tubes 1,2 et 3 reçoivent deux €. c. d’une solution de galactose à 7,09 0/0 et le tube 4 deux c. c. d’une solution de glucose à 10 0/0.
Une heure après l'introduction du sRRir sucré, le da ment gazeux commence dans les tubes 3 et 4 et seulement au bout do heures dans le tube 2, La levure du tube 3 s’est done accoutumée au galactose, celle do tube 2 a conservé une partie de ses anciennes propriétés malgré la porportion assez grande de glucose que cette levure a dû décomposer. Son accoutumance n’a done pas disparu.
La levure du tube 7 épuisée par une première fermentation de glucose, renfermant un protoplasma vieilli, n’a cependant pas perdu la propriété de s’habiluer au galactose. Elle y met beaucoup plus de temps que précédemment la levure du tube 5. Son temps mort est de # jours au lieu de 24 heures, mais ce temps est sans importance, cette levure s’accoutume encore.
L'exemple que je viens de rapporter est relatif à une levure qui s’acclimate assez facilement.
Je résume dans un tableau synoptique l'exemple d'une autre levure (une levure de bière haute : la levure Bass) qui compte parmi les plus longues à s’acclimater.
Tube 1. Tube 2. Tube 3. Tube 4,
recoivent #€,c. Solution de glucose. reçoivent # c.c. solution de galactose,
La fermentation commence après / nn — a — 2 heures. 2 heures. #8 heures. 2 heures.
Tout dégagement gazeux cesse après
—— — ARE ES Te ms 5 Jours, 5 jours. 10 Jours, 5 jours.
On ajoute après la fin du dégagement gazeux du = nn — A
£alactose. gaiactose. galactose. olucose.
La fermentation commence après En A TT 5 jours. 12 heures. | heure. | heure.
On ajoute du galactose dans le tube #4, la fermentation commence au bout de 12 heures.
Ces deux exemples nous montrent donc que lorsqu'une levure accoutumée au galactose fait fermenter du glucose, elle perd en parlie son acclimalation. Mois dans le cas de levure en masse, celte perten “est que partielle. Avec la levure Bass, où
cette perte est maximum, une levure ainsi traitée se rappelle encore très bien son acclimatalion primitive.
Celle propriété est donc d’une stabilité relative, mais il reste
acquis. pour que l’accoutumance reste maximum, que la pré<ence du galactose est nécessaire, Cest ce qui arrive également chez les animaux dont l'organisme immunisé contre une toxine perd de son immunité dès que la toxine cesse d'agir jusqu’à devenir nulle au bout d'un temps plus ou moins long.
… Expérience IV. — Complétons l'expérience précédente, mais au lieu de faire agir la levure en masse sur une solution de sucre fermentescible par elle, laisous-la macérer dans l’eau distillée ou en présence d’un sure non fermentescible par elle comme le lactose. Au bout de 8 jours on introduit sur cette levure une solution de galactose. Si celle-ci, avait été préalablement acelimatée au galaciose, la fermentalion commence rapidement mais cesse bientôt, l'alcool produit devenant nuisible.
Une levure habituée au glucose s'acclimate très bien au galactose après celte macéralion et est même moius sensible à influence de l'alcool que précédemment la levure habituée au valactose.
De cette expérience nous retenons ce fait qu'une levure acclimatée, restant dans l’eau sans addition de sucre, conserve la propriété d'attaquer au bout de 1 ou 2 heures le galactose qu'on lui fournit. Quant à l'action funeste de l'alcool, elle peut tenir à des causes très variées sur Ja nature desquelles nous ne pouvons entrer.
Il faut done, pour que la levure perde son accoutumance, qu'on lui fournisse un sucre fermentescible autre que le galactose.
En résumé, nous venons de voir el de démontrer qu'une levure dont le développement s'était elleetué en l'absence de galactose éprouve pendant un certain temps une sorte de répulsion pour ce sucre avant de l’attaquer. Nous désignerons ce temps sous le nom de période d'accoutumance.
Une fois habituée au galartose, la levure possède la propriété de décomposer le glucose 1,6 lois plus vite que le galactose.
Cette accoutumance peut disparaitre en partie perdue quand un autre sacre est donné à fermenter à la levure; mais, en laissant simplement la levure macérer dans l’eau, elle ne perd pas la faculté d attaquer rapidement le galactose: si elle est accou-
SÉRYRES
tumée, elle devient seulement plus sensible à l’action de l’alcool.
INFLUENCE DE CERTAINES SUBSTANCES SUR L’ACCOUTUMANCE ET LA FERMENTATION DU GALACTOSE
Maintenant que nous savons qu’une période d’accoutumance existe chez toutes les levures non habituées au galactose, étudions l'influence possible, même probable, de diverses substances qui peuvent favoriser ou retarder le moment où la levure devient capable d'attaquer ce sucre. Ces substances peuvent être indifférentes pendant la période d’accoutumance, mais agir sur la fermentation du galactose et l’entraver.
Avant d'entrer dans l’étude de l’action de ces substances, je signalerai certains corps ou même certains facteurs qui sont indifférents soil sur l’accoutumance, soit sur la fermentation du galactose. |
Causes indifférentes. — 11 demeure entendu qu'il n'existe aucune relation pouvant différencier les levures hautes des levures basses dans la durée d’acclimatation des levures au galactose. Cette durée est très variable, elle est de 3 heures pour une levure de lactose et de 72 heures pour certaines levures de bière.
Le milieu nutritif qui a servi au développement de la levure avant son introduction dans les tubes flambés est également indifférent. Ainsi je remplaçai l’eau de touraillons qui me servait comme milieu de culture par du liquide Raulin, du liquide Lau rent, de l’eau de levure, des bouillons, etc., et les levures développées dans de tels milieux, mises en masses, se comportaient exactement de la même manière quand on les faisait agir sur une solution de galactose pur.
Causes Qui INFLUENT : Influence de l'air. — Ce n'est pas un facteur qui intervient d’une façon très sensible. Dans certaines conditions toutes spéciales on peut mettre son influence en évidence. Nous avons vu qu'une levure de lactose habituée au glucose pouvait attaquer le galactose au bout de 2 heures. Or, une condition est nécessaire pour obtenir ce résultat, c’est que la levure ait à sa disposition une certaine quantité d'oxygène. Si
on remplace nos matras de Bohême qui nous ont servi commê ballons de culture par un ballon permettant de faire une culture en profondeur, on constate que la durée d’accoutumance a considérablement augmenté et atteint 8 et même 12 heures. En diminuant Parrivée de l'air, on retarde l’acclimatation. Pour les autres levures, l’air semble être indifférent.
Influence de la concentration du sucre. — Dans les expériences rapportées précédemment, j'ai toujours fait développer mes levures dans des milieux contenant 2 0/0 de sucre. Cette concentration avait été choisie de telle sorte que la levure, au bout de 3 jours, ait fait disparaître tout le sucre. On eût pu, dans la majorité de nos expériences, opérer avec une concentration moitié moindre, excepté dans l'expérience suivante.
Si nous ensemençons une levure de lactose dans des liquides dont la concentration du sucre aille en décroissant, on constate que cette levure mise en masse en présence de galactose s’acchimate plus où moins rapidement selon la concentration du liquide originel. Ainsi, en opérant avec de l’eau de touraillons renfermant 2 0/0, 4 0/0 et 0,5 0/0 de glucose, nous avons obtenu les résultats suivants :
Concentration du glucose, Durée d'accoutumance, 29/9 3 heures.
OVES 8 heures.
0,5 °/o 36 heures.
Plus il y avait de sucre originellement, plus la durée d’accoutumance est courte, Certaines levures de lactose qui semblaient faire un groupe à part, à cause de leur courte durée d'accoutumance rentrent dans la catégorie des autres levures quand on diminue la concentration du sucre du milieu de culture.
Avant de passer à l’étude des substances qui influent soit sur l’accoutumance des levures au galactose, soit sur la fermentation de ce sucre, il faut ouvrir une parenthèse nécessaire pour expliquer les modifications techniques qu'il a fallu apporter dans le but d'éviter de grossières erreurs.
Absorption du galactose par les levures. — Si on prend une levure en masse habituée seulement au glucose, par exemple, et qu'après l'avoir fait agir 12 heures sur une solution de galactose oh dose le sucre restant (toui dégagement gazeux n'ayant pas
eu lieu) on constate une disparition de sucre non accompagnée de g»z carbonique.
Voici en elfet quelques résultats :
Levures. Concentration du galactose. Sucre restant, Poids levure milligr. Levure de vin N° 6. 6 9/6 5,29 250 Levure de bière Bass. 60/, »,00 209 Distillerie Alfort. 6 0 5,09 290
Avec les levures inactives vis-à-vis du galactose, on trouve des résultats identiques:
S, Ludwgii, 60}, 5,20 540 S. Apicuiatus. 60}, 5,20 360
Cette propriété semble spéciale au galactose. Avec les levures ne sécrélant pas de mallase ou de lactase, le mallose et le lactose introduit à la place de galactose se retrouve intégralement dans les conditions de l'expérience précédente.
Il n'est pas nécessaire d'employer des levures pour constater cela. En diffusant simplement avec des dialyseurs ordinaires une solution contenant soit du galactose pur, soit un mélange de glucose et de galactose,'on constate encore une absorption de galactose. La membrane dialysante était en parchemin animal. En avalysant au bout de 4 heures les différentes proportions de
galactose et de glucose dialysé nous avons trouvé les résultats suivants :
Sucre introduit Sucre dialysé Sucre non dialysé Différence en milligr. en milligr, en mihigr. en milliur. 2e — — re a— ne | er
glucose. gaiacluse, glucose. galactose. glucose. galactose. gala tose. 154 0 68 0 86 0 0 102 48 45 15 57 27 8 ol 97 22 31 28 54 16 ( 145 D 45 ( T1 25
La quantité de sucre manquant représente du galactose et celle-ci croit propartionnellement à la concentration du sucre.
Pour désigner cette disparition de galactose, nous dirons que le galactose a été absorbé par la levure,
Cette alsorption de galaclo<e doit être consécutive d'une diffusion, car il suffit de tuer les levures en les portant à 100 pour empêcher ce fait de se produire. '
do |: Notes
Ces phénomènes d'absorption ont été déjà signalés par Graham, je ne les mentionne que pour expliquer les modifications que j'ai dû apporter aux procédés d'analyse, Une fois la levure acclimatée, le galactose absorbé disparait.
Si nous nous étions contentés de diser ce galactose restant après l'action d’une levure en présence d’un antiseptique, par exemple, nous aurions pu faire de grossières erreurs dues à l’absorpüon de galactose qui aurait été compté comme sucre disparu par la fermentation. Nous nous sommes mis à l'abri de cette erreur en dosant l'acide carbonique résultant de la fermentation.
Substances empêchant toute accoutumance. — J'ai apporté à la technique suivie jusqu'ici quelques modifications que je vais indiquer. Biernacki, dans ses études classiques sur l'action des antiseptiques, a montré que ces corps agissent et selon leur poids et d'après leur con-entration. Elle dépend en outre de la quantité de levure employée.
Il fallait donc trouver un moyen de sécher une levure tout eu la conservant pure, et de la peser également sans l'infecter.
Dans un tube à essai assez large et préalablement flambé, j'introduis de l'acide sulfurique pur. D'autre part je prends un petit tube contenant de la levure en masse et pure. Ce tube flambé extérieurement est introduit rapidement dans le tube plus large contenant SO‘H? aussitôt qu'un aïde à retiré le bouchon de co on du petit tube de façon à accelérer la dessiccation de la levure. Les deux tubes encastrés l'un dans lautre avaient l'aspect que représente la figure ci-contre. Les tubes ainsi préparés sont plarés sous la cloche à vide à la température de 25°. Le temps de séchage dure 4 à 6 jours suivant la levure. Celle-ci sèche, on retire le petit tube au moyen d'une pince. L'aide remet un bouchon flambé et on pèse le tube plein. Celui-ci avait été préalablement pesé vide, l'augmentation du poids représentele poids de la levure sèche.
Sur cette levure sèche on introduit 2 ce. c. d’une solution de glucose ou de galactose avec l'antiseptique à étudier On place ce petittube daus un ballon à col assez long, on y fait le vide et
ile,
on ferme le ballon à la lampe. On dose l'acide carbonique dégagé.
Influence de l'acide borique. — On sait que l'acide borique agit d’une façon toute particulière sur la levure en facilitant son dépôt. Son action n’en est pas moins intéressante sur l’accoutumance des levures au galactose. Si on fait agir une levure en masse habituée au glucose sur une solution de galactosé additionnée de 0,66 0/0 d’acide borique, on ne constate aucun dégagement gazeux. La levure est dans l'impossibilité de s’acclimater à ce sucre. On obtient le même résultat si, au lieu d'employer une levure séchée, on employait une levure jeune.
Mais, à la place d’une solution de galactose, employons une solution de glucose. La fermentation se déclare aussi rapidement qu’en l’absence d’antiseptique. La dose d’acide borique employée n'élait pas suffisante pour empêcher toute fermentation alcoolique du glucose, elle est largement suffisante pour ne pas permettre à une levure de s'accoutumer au galactose.
Pour bien montrer que l’acide borique n’agit pas en empèchant la fermentation du galactose, nous remplaçons notre levure habituée au glucose par la même espèce habituée cette fois au galactose. L’acide borique, dans cette expérience, agit sur la fermentation du galactose comme sur celle du glucose, en diminuant légèrement à cette dose l’activité de la fermentation.
Avec une levure accoutumée au galactose :
Vitesse fermentative du glucose
Le rapport R = memes est après 24 heures sensiblement égal encore à 1.6.
L’acide borique agit donc simplement sur la cellule non acclimatée, empêchant le travail interne d’accoutumance de se produire.
Pour toutes nos levures, l'acide borique s’est comporté de celte façon.
L'existence des levures inactives vis-à-vis du galactose tient, peut-être, à la présence dans leur intérieur d’une substance agissant à la manière de l'acide borique, et artificiellement avec cet antiseptique nous arrivons à faire passer, dans la catégorie des levures inactives, une levure réputée active vis-à-vis du galactose. |
La présence de glucose n'empêche pas laction de l'acide
mn R —
borique sur l’accoutumance. En faisant fermenter un mélange de glucose et de galactose en présence d’acide borique avec de la levure en masse habituée au glucose ‘ on retrouve inattaqué le galactose introduit.
Si, au bout de 24 heures, le rapport R = 1,6, il ne faut pas croire qu'il en sera toujours ainsi si on note la durée du dégagement gazeux, on trouve les résultats suivants :
Sucre introduit 440 milligr. Durée de Ja fermentation. Poids levure milligr. [ +2 c.c. glucose. 3 jours. 65 Levure + 2 c.c. galactose. 6 jours. 82 acclimatée + 2 c.c. glucose + 0 c. ce. 02 B,DS 5 jours. 65 “+ + 2 c.c. galactose + 0,02 — 6 jours. 102 D rtose + 2 c.c. glucose + 0,04 — À jours. 13 s + 2 e.c. galactose + 0,04 — 10 jours. 17
On peut remarquer la durée assez longue de la fermentation du galactose en présence de 0 c. c. 04, de B,0*. Ce résultat tient à l'influence de l'alcool combiné avec celle de ce corps.
En résumé, l’acide borique agit sur les levures non habituées au galactose etempêche toute accoutumance.
Son action sur la fermentation du galactose est comparable à celle sur la fermentation du glucose.
Influence du toluène. — Le toluène comme l'acide borique empêche l’accoutumance au galactose. Les levures de lactose habituées au glucose font exception à cette règle générale. En étudiant l'influence de l'acide borique, nous avons laissé de côté ces levures parce que leurs cellules sont très sensibles à l’action de ce corps aux doses que nous employions.
Les levures de lactose habituées au glucose sont en partie accoutumées naturellement au galactose, aussi s’explique-t-on la non-influence du toluène sur elles.
Le toluène possède le désavantage d’être peu soluble dans l'eau; nous avons été obligés, dans l'impossibilité de varier les doses, d'opérer dans des conditions telles que le liquide sucré en était saturé. Dans nos tubes renfermant les levures en masse, on ajoute le liquide sucré et une épaisseur de 1 em. de toluène, de façon à maintenir l’eau saturée, ce corps étant assez volatil.
Aussitôt que l'antiseptique a disparu, les levures non accli-
1. Les levures habituées au levulose, malltose et saccharose se comportent «omme les levures habituées au glucose.
EC T ies
matées s’accoutument au galactose, sauf dans quelques cas particuliers que nous rencontrerons plus loin.
Mais entre l'action du toluène et celle de l'acide borique existe une différence, Avec ce dernier, 100 my. de levure font disparaître facilement 400 mg. de galactose dissous dans 2 €. € de liquide. Avec le toluène le dégasement gazeux cesse 12 à 24 heures après le commencement de la fermentation. La proportion de sucre fermenté est à peu près de 2 0/0. Voici quelques résultats obtenus avec une levure accoutumée au galactose- et
additionnée soit de glucose, soit de galactose.
Sucre fermenté Poids de 0/0 Jevureen mil).
Levure de vin mise en présence de 2? c.c. Sol. glucose +1 c.c. toluène. 1,7 53 — — — galactose + — 1,6 50 Lev.dedistillerie — — glucose + — 1,52 33 — — — galactose + — 1,91 30
Le toluène agit sur l’acclimatation et aussi sur la fermentation alcoolique et avec la même énergie, quelle que soit la nature du sucre décompose.
Cette action du toluère est due à l'influence de ce corps augmentée de cel'e de l'alcool.
Il suffit d'ajouter des solutions sucrées additionnées de 1 0/0 d'alcool avec le toluène pour ne pas constater de fermenta'ion. Le protoplasma de la cellule est atteint, car en faisant macérer une levure dans l’eau additionnée de 1 0/0 d'alcool et de 1 c. c. de toluène on constate après 4 jours que la levure est morte. Au microscope, la levure laisse voir un protoplasma très granuleux,
Le toluène seul exerce déjà une certaine action sur les levures. Si l'on prend une levure acclimatée où non au galactose et qu'on la fasse macérer dans l’eau additionnée de toluène pendant 8 jours à 25°, on constale un retard dans l'apparition du dégagement gazeux, quand on fait agir de la levure sur le galaciose où un aatre sucre.
Voici pour une levure ce qu'on trouve:
Dégagement gazeux Poids de
manifeste au levu e bout de : en millig.
Levure acclimatée ( 2 c.c.Sol. glucose 10°/, +0c.c.2toluène, 2 heures 73 mise en présence de : — galartose 1Do/, + — 2 heures 70 Lire nou 2c.c. Sol. glucose10/, +0 c.c.2toluëène. 6 heures 84 une mise cl ee galactose 10 °/, + — 3 Jours 100 PES | SIUCOSC EE ADR TOO AE . 2 heures 88
— galactose. ., RO DT TT ue 2 jours 80
Dans toutes ces expériences, la levure non acclimatée semble plus sensible à l'action du toluène que la levure acclimatée.
L'action combinée de toluène et d'alcool, comme dans les expériences de Biernacki est plus forte que celle résultant de la somme des actions réciproques de ces deux corps.
Quand on cultive les levures dans des milieux riches en peptone. L'influence du toluène se fait beaucoup plus sentir.
Nous mettons en masse dans des tubes une levure provenant d'une culture dans l’eau de touraillons additionnée de 1 0/0 de peptone et on ajoute dans chacun une solution de toluène dans l'eau. Au bout de 4 jours la quantité de toluène est évaporée, on ajoute alors une solution de galactose et on constate ceci. Dans les tubes qui renferment la levure acclimatée un dégagement gazeux commence après 24 heures, tandis que les levures non acclimatées soumises à ce traitement sont devenues incapables de s’acclimater. La levure est cependant vivante, il suffit de la transporter dans un milieu nutritif sucré pour qu’elle se développe facilement.
Reprenons les tubes contenant une levure en masse acchimatée au glucose en présence de peptone, mais au lieu de la faire agir sur une solution de galactose, nous introduisons dans le tube uve solution de glucose avec 0,2 c.c. detoluène. On ne constate de fermentation qu'après la disparition du toluène. La levure n'était pas morte et il y a lieu de penser que pendant la macération dans l’eau additionnée de toluène, celle-ci a perdu sa zymase détruite par ce traitement.
La levure non accoutumée traitée comme nous venons de l'indiquer et, transportée dans l’eau de touraillons additionnée de galactose, ne peut se développer n1 faire fermenter ce sucre. Voici une levure qu'une simple macération dans l’eau additionnée de toluène rend donc inactive vis-à-vis du galactose.
Pour lui rendre son activité il suffit d'ajouter une trace de glucose qui, redonnant la jeunesse aux cellules, les mettent dans les conditions nécessaires pour s'accoutumer au galactose.
Les levures accoutumées soumises au traitement du toluène peuvent très bien se développer dans l’eau de touraillons galactosée, [lsemble même que, dans ces conditions, la zymase de ces levures résiste bien mieux que celle des levures non accoutumées.
et
Comme ces phénomènes d’acclimatation sont assez généraux nous pouvons rechercher des rapprochements chez les microbes avec les faits que nous constatons.
Ainsi cette action du toluène sur la zymase d’une levure peut être rapprochée, à mon avis, avec ce qui se passe chez un microbe très virulent. Ce microbe, placé primitivement dans des conditions très favorables, se développe, mais son activité passe par un maximum, Au bout d’un certain temps les conditions deviennent défectueuses et les cellules résistent d’autant moins que l’activité avait été plus grande, le microbe perd de sa virulence. Pour la récupérer il lui faut des conditions spéciales, comme dans notre expérience la présence du glucose est nécessaire à la levure.
On peut remplacer l’eau de touraillons peptonisée par d’autres milieux, mais les résultats sont moins frappants. Ils diffèrent, suivant les levures.
Voici quelques résultats :
Durée de
; l’accoutumance.
Levure de vin cultivée dans eau de levure peptonisée 1 °/,+ saccharose. 9 jours
— — liquide Laurent — Lo, + — 8 Jours Lev. de distill. — eau de levure — 19/0 + — C2 liquide Laurent — 40/0 + — 9 jours
Mais où l’embarras commence, c’est quand on veut fournir une explication satisfaisante des résultats obtenus. On pourrait dire, par exemple, en admettant avec Buchner que l’action des diastases protéolytiques détruit la zymase, que la peptone a favorisé la sécrétion de ces diastases et qu’en présence de toluène ces diastases protéolytiques ont continué à agir, peut-être ont augmenté d'activité et ont détruit la zymase. Cette explication ne repose sur aucun fait bien précis. La vérification est difficile, et les expériences que j’ai entreprises dans cet ordre d'idées ont toujours abouti à des résultats négatifs. Je veux bien croire que ces Insuccès n'infirment rien, les diastases protéolytiques agissantes pouvant ne pas diffuser.
On peut donner une autre explication, qui ne nous renseigne pas davantage sur le mécanisme de la destruction de la zymase, mais qui repose sur une observation dont la généralité semble s'étendre sur beaucoup de cellules. Toutes les fois qu’on augmente outre mesure l’activité d’une cellule, il se produit bientôt une réac-
tion inverse qui tend à affaiblir cette cellule rendue précédemment trop active. Ge fait semble général même pour les cellules des organismes. Quand on fournit des excitants à des animaux, à l’excitation survient l'abattement. Si à ce moment une cause nuisible survient, l’action nuisible se trouvera augmentée par suite de l’affaiblissement de la cellule. C'est ce qui arrive aux levures développées en présence de peptone et sur lesquelles le toluène a ensuite agi. Du reste, toute cause capable d'augmenter l’activité d’une cellule doit être suivie d’un affaiblissement. Ainsi, le phosphate d’AzH* remplaçant la peptone dans le milieu de culture fournit des levures sensibles à l’action du toluène, mais moins sensibles que dans le cas de la peptone.
Une levure habituée au glucose agissant sur un mélange de glucose et de galactose additionné de toluène ne fait pas fermenter le glucose seul. Le même résultat est obtenu avec une levure acclimatée au galactose. Pour expliquer ce fait qui semble anor-mal, nous ferons remarquer que le glucose fermente plus vite que le galactose. Or les petites quantités d’alcool produites au commencement suffisent pour modifier l’intérieur du protoplasma et rendre diflicile la diffusion du galactose. En faveur de cette hypothèse, je citerai l'expérience suivante : Sur une levure acclimatée je mets 5 c. c. d’une solution de glucose à 10 0/0 et, la fermentation terminée, je soutire le liquide fermenté et lave la levure à l’eau distillée. J'introduis sur la levure, à la suite de ce lavage, une solution de galactose avec un excès de toluène ; dans un autre tube traité de la même manière j’introduis une solution de glucose avec également un excès de toluène. Je dose l’acide carbonique dégagé et j'obtiens les résultats suivants.
COZ dégagé à 0oet à 760° 7%;
Tube renfermant solution de glucose.....,...,..,... PM Ml — — PARC IDSO rene. UNG Dies
Cette ditférence ne peut guère s'expliquer que par la difficulté de la diffusion du galactose dans un protoplasma ainsi vieilli.
En résumé, le toluène, comme l'acide borique, empèche l’accoutumance des levures, mais son action s'exerce également sur la zymase, dont il facilite la destruction, surtout si la levure
n'est pas acclimatée, et dans des conditions spéciales définies dans ce paragraphe.
Son action s’exerce encore sur le protoplasma quand il est mélangé à l’alcool. La mort de la cellule survient alors très rapidement.
SUBSTANCES AGISSANT SUR LA FERMENTATION DU GALACTOSE. — Étudions maintenant certains corps qui sont sans influence sur l’acclimatation des cellules mais dont l’action peut être plus nuisible dans le cas d’une fermentation de galactose que dans celui d’une fermentation de glucose. Parmi celles-ci je citerai pour commencer les acides.
Influence de l'acide malique. — Je cite le cas de l’acide malique, ayant déjà parlé au chapitre II de l'influence de l'acide tartrique.
Si on fait agir une levure en masse accoutumée ou non au galactose sur une solution de galactose ou de glucose, additionnée d’acide malique, on constate au bout d’un temps plus ou moins long, suivant que la levure est ou non acclimatée, un dégagement gazeux, qui césse assez vite quand la levure agit sur le galactose. |
Voici en effet quelques chiffres.
Liquide introduit dans chaque tube Sucre fermenté contenant 70 milligrammes de levure non acclimatée, en milligr. CC ASOIULONTAE TS IUCOSE A AL) RE A CR Te 240 - derpolactose aus 20 PE PRET EE A COR 264 — — de glucose + 1 c.c. Sol. acide malique à 2,75 °/° 210 — — de galactose + — — — — 20% = = de glucose + SE 240 — — de galactose + 101 — de glucose + 14501076 240 — — de galactose + — — — — 29
L'action de l'acide malique est indépendante du poids de levure employé. Ainsi, au lieu de 70 milligrammes, nous faisons agir 7 miligrammes seulement ‘ de levure additionnée d’acide malique. Nous trouvons comme sucre fermenté :
à Sucre fermenté La levure reçoit. f
en milligr.
2 c. c, Sol. de glucose à 180/, + 1 c.c.Sol.acide malique à 2,75°/, 366 — de galactose à210/, + — — — — 366 — de glucose à180/, + DD 300 de galactose à 210/, + — — — 967
. 4. Pour obtenir une petite quantité de levure, nous opérons ainsi : On introduit 40 e. c. dans l’eau de touraillons sucrée dans un tube à essai. On ensemence et la fermentation terminée, on soutire le liquide fermenté en laissant la levure au fond du tube.
LE POer RE |
L'influence de la nature du milieu originel se fait également sentir ici. Ainsi l’action de l’acide malique sur la fermentalion du galactose est plus faible quand la levure s’est développée dans un milieu riche en peptone ou en phosphate d'AzH®.
Avec la même levure dont j'ai rapporté les résultats à la page précédente on trouve :
Levure cuitivée dans l'eau de touraillons peptone 20/5 Sucre fermenté additionnée de : en milligr.
2. c. glucose 180/9 Æ 1e, c. acide malique à 5,5 360 — galactose Ao/, LE — — — 3TS Levure cultivée dans l’eau de touraillons phosphate d'AzH4 2 04, Sucre fermenté additionnée de : en milligr.
2 c.c. glucose :8°/, + 1 c. 0. acide malique à 5,5 0/0 360 — galactose 20/, + — — — 298
Enfin nous ajouterons pour finir que le rapport
R —— vilesse fermentation du glucose
vitesse fermentation du galactose varie entre 1,5 à 1,7, après 24 heures de fermentation. Nous voyons encore ici que ce nombre varie peu.
En résumé, l'acide malique n'empêche pas l’accoutumance des levures au galactose, mais exerce son action sur la fermenlation du galactose, action bien moins sensible quand on remplace ce sucre par du glucose.
Influence de l'alcool. — L'action de ce corps ressemble beaucoup à l’action des acides; ce n’est que par le détail que leurs actions diffèrent. Pour l'alcool le poids de levure intervient.
Déjà, au chapitre Il, nous avons vu qu'une levure décomposait moins de galactose que de glucose. Cet arrêt tenait déjà à l'influence de l'alcool. Ajoutons dans des tubes contenant 7 milligrammes environ de levure 5 c. ce. d’une solution de olucose ou de galactose additionnée de doses variables d'alcool. de façon à obtenir des concentrations de 4,4 0/0, 8,3 0/0, 13 0/0 en
volume. Avec une levure accoutumée nous avons obtenu les résultats
suivants :
Chaque tube recoit Sucre fermenté 0/0
$ e.c. de glucose à 15,010/° + 4,4 ‘le alcool, 15,01 — de galactose à 18,59 0/0 + = — 1,52 — de “glucose A AS 0lo/o Er SUN 15,04 — de galactose à 18,59 10 + = == 4,47 = de glucose à 15, e 0/0 + ! — 411,41 — de galactose à 18,5 on — 4,30
L'alcool n’influe pas sur l’acclimatation, mais exerce une action nuisible sur la fermentation du galactose.
Son action dans ce cas pourrait tenir à une coagulation du protoplasma des cellules. Or il n’en est rien et il semble bien que dans ces conditions l'influence de l'alcool se fasse seulement sentir sur la zymase. Si dans chaque tube ayant fait fermenter une certaine quantité de galactose on ajoute une solution de glucose additionnée d’une dose suffisante d'alcool, de façon à ne pas changer le degré alcoolique du liquide de chaque tube, on obtient une fermentation, le galactose restant inaltéré.
L'action de l'alcool sur la zymase semble comparable à l’action du maltose sur l’amylase.
L'intérieur du protoplasma était, bien entendu, très granuleux et, dans ces conditions, le galactose diffuse mal.
Cette condition serait insuffisante pour expliquer l'arrêt de la fermentation du galactose, car en augmentant la dose de levure, l’influence de l'alcool diminue.
Si, en effet, on opère avec une levure en masse et qu’on fasse agir celle-ci sur une solution de glucose ou de galactose additionnée d’alcool de façon à obtenir une concentration alcoolique de 10 0/0 et 15 0/0 d'alcool, on trouve que la fermentation s'arrête pour les deux sucres quand la dose d'alcool est identique dans les deux cas.
Voici en effet les quelques résultats obtenus :
La levure reçoit. Temps mort. f OR Le CE ermenté 0/o milligr.
2c.c. Solution de glucose à 16,45 °/, ins 16,45 65 — —. de galactose à 13,41 o/, 2h. 13,41 82 — — de glucose à 16,41 °/, 3h. 16,45 84 — — de galactose à 18,41 ./° 3h. 13,41 85 — — de glucose à 16,45 0/, 8 h. 1,95 125 — degalactose à 13,41 °/, 8h. 8,40 120
Il est naturel d'admettre que l'alcool exerce son action coagulante sur le protoplasma des cellules quand sa concentration atteint un certain degré, et indépendamment du poids de levure en présence, que par conséquent on ne peut attribuer à un défaut de diffusion l’arrêt de la fermentation du galactose quand, avec une dose moindre de levure, la fermentation du galactose est arrêtée pour un degré moindre d’alcool.
Si on fait agir la levure en masse aussitôt l’arrêt de la
fermentation obtenue, aucun autre sucre ne peut être décomposé par la levure. Même en évaporant l'alcool la fermentation continue difficilement, ce qui indique une modification intérieure de la cellule.
En résumé, l'alcool agit de deux façons : sur la zymase quand il y a peu de cellules, et sur le protoplasma quand la quantité de levure est en grand excès.
Action de quelques autres corps. — Pour terminer je dirai quelques mots de deux antiseptiques puissants : le sublimé (HgC/) et l'acide phénique (C*HSO).
Le sublimé à faible dose est un antiseptique puissant. Empèche-t-il l'acclimatation au galactose? En opérant avec la levure en masse, j'ai pu me convaincre que non, et avec une levure non accoutumée la quantité de sucre était la même, que ce soit du glucose ou du galactose.
Voici quelques résultats :
: Sucre fermenté Poids levure Les tubes recoivent.
9/0 en milligr.
2c.c. Sol. glucose à 22 o°/, H 0sr,003 HgCI2. 22,00 62 — galactose à 13,41 0/9 EL — — 13,41 db — glucose à 22 o/o + 0er,006 — 2,38 48 — galactose à 13,410), + — — 2,13 57
L'acide phénique agit un peu de la même manière. Il n’entrave pas l’accoutumance.
Il est donc intéressant de faire remarquer qu’un antiseptique puissant, pouvant arrêter rapidement la fermentation et le développement des cellules, puisse agir, à dose légèrement au-dessous de la dose antiseptique, avec moins d’énergie pendant le travail d'acclimatation que d’autres corps tels que l'acide borique bien moins antiseptiques que les précédents.
Il n’y a donc aucune relation entre la puissance antiseptique et la puissance antiacclimatante si on peut s'exprimer ainsi, c'està-dire la quantité de substance nécessaire pour empêcher l’acclimatation.
Cette observation peut avoir une certaine importance partout où se manifestent des phénomènes d’accoutumance. Ainsi, dans la lutte contre les microbes, les phagocytes doivent s'accoutumer à leurs toxines. [l peut se trouver quelques substances dans le sang qui retardent et même entravent l’'acclimatation des leuco-
cytes, comme il peut se faire que lemploi de certains antiseptiques sans influence sur l’accoutumance aux toxines, empêche le développement du microbe, arrêtant ainsi la sécrétion de la toxine. C’est à un phénomène du même ordre qu'on peut attribuer l’emploi du chlorure d’iode dans la production du sérum. Peut-être trouverait-on dans cette voie un auxiliaire de sérums.
En résumé, nous avons vu dans ce chapitre que l’on pouvait classer les antiseptiques, dans le cas qui nous occupe, en quatre catégories :
1° Celle renfermant les corps qui n’agissent que sur l’accoutumance (ainsi l'acide borique);
2e Celle renfermant les corps qui. comme le toluène, empêchent l’acclimatation et entravent la fermentation du galactose comme du glucose ;
3° Celle renfermant les corps qui, comme l'alcool, les acides, entravent la fermentation du galactose et sont, pour ainsi dire, sans influence sur celle du glucose:
40 Celle renfermant les corps qui, sans entraver l’accoutumance, arrêtent rapidement la fermentation alcoolique de n'importe quel sucre (sublimé, phénol, alcool sur levure en masse).
L'acclimatation d'une levure est donc le résultat d’un phénonomène qui nous apparaît comme compliqué, et comme elle est empêchée par certaines substances qui n’arrêtent pas la fermentation, on pourrait croire que le travail qui s’accomplit dans lintérieur des cellules’ se produit seulement dans une portion spéciale de la cellule ayant ses exigences propres.
