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AUTRES BACILLES ANAÉROBIES 83

Avec les propriétés énoncées, ces bacilles semblent, en efïet, difTérents les uns des autres. Mais s'ils nous paraissent appartenir à des types différents, c'est peut-être qu'ils sont peu nombreux et qu'on ne connaît pas de types intermédiaires. Quand on en trouvera d'autres, ils se placeront peut-être entre les précédents pour leur servir de trait d'union. Nous verrons au moins que tel a été le cas pour les êtres aérobies, ({ui sont mieux connus. Là, les types de transition abondent, si bien qu'on ne sait plus où sont les limites entre des espèces qui à l'origine semblaient absolument distinctes.

A côté des bacilles purement anaérobies que nous venons d'étudier, viennent se placer d'autres êtres, étudiés de moins près parce qu'ils l'ont été à une époque où la science sur ce point commençait à peine. Ils devraient être aux premiers rangs dans une étude historique. Nous sommes obligés de les mettre aux derniers, pour pouvoir faire bénéficier leur physiologie des notions plus précises apportées par ceux qui sont mieux connus.

53. Ferment butyrique de Pasteur. — Ce ferment est le premier en date des bacilles anaérobies. Il date malheureusement d'une époque où aucune méthode précise ne permettait d'assurer la pureté des cultures. Pasteur n'avait pour cela que le critérium de l'inspection microscopique, que sa longue habitude avait rendu très fm et très sûr, mais qui restait un peu indécis lorsqu'il sagissait de dire si tous les bacilles -qu'on rencontrait dans une même goutte de culture appartenaient ou non à une même espèce. Il y en avait heureusement un autre, c'est que des réensemencements successifs dans le même milieu assuraient de plus en plus la pureté de l'espèce qui s'y développait le mieux. C'était la méthode que Pasteur avait employée pour la purification des levures par culture dans des milieux sucrés. C'est celle qu'il employa quand il commença l'étude des fermentations butyriques. Enfin pour

elles il avait un critérium de pureté de plus, c'est que leur caractère purement anaérobie permettait de les séparer d'une foule d'espèces aérobies vivant dans les mômes milieux.

Dans l'espèce, le ferment butyrique de Pasteur présente un double intérêt : 1" c'est lui qui a fourni les premières notions sur la vie anaérobie, et ces notions sont devenues si importantes qu'il y a intérêt à savoir comment elles ont pénétré dans la science ; 2" malgré la pauvreté des moyens de séparation, le ferment parait avoir été une espèce pure ; on a pu longtemps conserver légitimement, sur ce dernier point, des doutes dont l'histoire du Bacillus orthobutylicus, que nous venons de faire, réduit de beaucoup l'importance.

S3. Découverte du caractère anaérobie. — On confondait autrefois la fermentation lactique du sucre en présence du carbonate de chaux et sa fermentation butyrique. Les deux fermentations s'accomplissaient quelquefois successivement, quelquefois chevauchaient l'une sur l'autre. Pelouze et Fremy en avaient fait une théorie qui considérait la seconde comme une conséquence pour ainsi dire régulière de la première. Elles avaient, au contraire, paru tout à fait distinctes et séparées à Pasteur dès qu'il avait commencé l'étude du ferment lactique, qui, dans un liquide sucré additionné de carbonate de chaux, n'allait pas au delà de la formation du lactate de chaux. Il fallait donc que le lactate de chaux, pour devenir du butyrate, subit l'action d'un autre ferment. C'est en cherchant ce ferment que Pasteur tomba sur son vibrion butyrique.

Cet être était mobile, ce que Pasteur exprimait dans le langage du temps, en disant : « le ferment butyrique est un infusoire », et en soulignant ces mots.

« J'étais bien éloigné de m'attendre à ce résultat, ajoute -t-il, à tel point que pendant longtemps j'ai cru devoir appliquer mes efforts à écarter l'apparition de ces

AUTRES BACILLES ANAEROBIES 85

petits animaux^ par la crainte où j'étais qu'ils ne se nourrissent du ferment végétal que je supposais être le ferment butyrique, et que je cherchais à découvrir dans les milieux liquides que j'employais. Mais, n'arrivant pas à saisir la cause de l'origine de l'acide butyrique, je finis par être frappé de la coïncidence que mes analyses me montraient inévitable entre cet acide et les infiisoires, et inversement entre les infusoires et la production de cet acide. » Après avoir connu la levure de bière et le ferment lactique, êtres immobiles. Pasteur entrait dans le monde des bacilles mobiles, qui est si peuplé pour nous aujourd'hui.

Dans cette même note, Pasteur décrit son ferment comme formé de petites baguettes cylindriques à bouts arrondis, isolées ou par chaînes, ayant une largeur de 2 [JL et une longueur variable. Ils sont mobiles, « s'avancent en glissant. Pendant ce mouvement leur corps reste rigide ou éprouve de légères ondulations. Ils pirouettent, se balancent ou font trembler vivement la partie antérieure et postérieure de leur corps. » Pasteur se trompe sans doute en disant qu'ils sont recourbés à une de leurs extrémités, parfois à toutes deux. Il attribuait à cette courbure ou à cette espèce de poche latérale et terminale, l'excès de réfringence observé à une extrémité du bacille et parfois aux deux, et qui était dû à la formation de la spore. Les microscopes qu'on avait alors permettaient cette erreur.

Enfin, dans cette note, Pasteur annonçait aussi que ces êtres vivaient sans oxygène libre, et même que l'air amené à leur contact les tuait. « Que l'on fasse passer dans la liqueur où ils se multiplient un courant d'acide carbonique pur pendant un temps quelconque, leur vie et leur reproduction n'en sont aucunement affectées. Si, au contraire, dans des conditions exactement pareilles, on substitue au courant d'acide carbonique un courant d'air atmosphérique, pendant une ou deux heures seulement,

tous périssent, et la fermentation butyrique liée à leur existence est aussitôt arrêtée ».

Plus tard, Pasteur est revenu sur l'histoire physiologique de ce bacille, en insistant, plus qu'il ne l'avait fait dans cette note, sur les conditions de l'expérience à laquelle le développement de ses idées sur Fanaérobiose lui avait fait donner de plus en plus d'importance. 11 opérait dans un ballon à 2 cols (B. fig. 4), contenant, pour 8 à 10 litres d'eau pure, le mélange suivant :

Lactate de chaux pur 223

Phosphate d'ammoniaque 0,75

— de potasse 0,4

Sulfate de magnésie 0,4

— d'ammoniaque 0,2

Le ballon plein, on en plongeait le col dans une capsule de porcelaine remplie du même liquide et on faisait bouillir

Fïs. 4.

simultanément le liquide du ballon et celui de la capsule. Au bout d'une demi-heure d'ébullition, quand l'air du ballon est sûrement chassé, on laisse refroidir celui-ci, en maintenant le bec de gaz sous la capsule, de façon que le ballon ne se remplisse, par refroidissement, que de liquide privé d'air. Puis, quand le ballon est plein, on le transporte dans une étuve chaulTée de 25 à 30'', en pion-

AUTRES BACILLES ANAEROBIES

géant dans un vase rempli de mercure l'extrémité de son tube abducteur.

On réunit alors la tubulure droite de B avec la tubulure correspondante d'un autre ballon A, dans lequel on emprunte la semence. En soufflant par la tubulure recourbée, on remplit du liquide de A le tube et le caoutchouc qu'on adapte alors sur la tubulure de B, au préalable remplit de liquide. On pousse alors en B un peu du liquide fermentant qui n'y apporte pas d'oxygène dissous, puisqu'il n'en renferme pas lui-môme.

La fermentation commence au bout de quelques heures. Du gaz se dégage, formé d'hydrogène et d'acide carbonique, et si, à un moment quelconque, on prend une goutte du liquide pour l'examiner au microscope, on retrouve les bâtonnets que nous avons décrits plus haut et on peut refaire l'observation caractéristique qui avait tant frappé Pasteur. Le mouvement des bacilles dans la goûte étalée sous le microscope commence à s'arrêter aux bords de la lamelle, là où l'air a le plus facile accès. C'est peu à peu,

Fig. S.

à mesure que l'oxygène pénètre vers le centre, que les mouvements s'y éteignent aussi. Il faut donc, pour voir ces mouvements dans toute leur vivacité, les examiner avec un

clisposiiir tel qu'en aucun moment de la manipulation, les bacilles n'aient le contact de l'oxygène. On y arrive facilement par le procédé suivant.

Quand la fermentation butyrique est en pleine activité dans le ballon ensemencé, on relie l'extrémité de la tubulure, au moyen d'un tube de caoutchouc, avec la lentille creuse biconcave figurée en // (fig. 5), placée sur le porteobjet d'un microscope. Cette lentille figurée plus en grand, en plan et en coupe, dans la fig. 6, est faite en verre souffié très mince, et ses deux surfaces sont assez rapprochées dans leur partie centrale pour que le liquide y soit dans les conditions ordinaires de l'observation microscopique.

Fis:. 6.

Pour la remplir, on ferme sous le mercure, en ô, (fig. 5) la tubulure de dégagement des gaz ; une pression s'exerce bientôt à l'intérieur du ballon, de telle sorte que lorsqu'on ouvre le robinet r, le liquide est chassé dans la lentille // qui se remplit complètement, pendant que l'excédant se déverse dans le verre. On peut donc, par cet artifice, observer les vibrions sans qu'ils aient aucun contact avec l'air, et comme si l'objectif du microscope était plongé dans le liquide du ballon. C'est alors un spectacle des plus attachants que d'observer les mouvements et la multiplication par scissiparité des vibrions, qui sont là comme dans le liquide de fermentation lui-môme, si l'on fait l'observation microscopique dans l'étuve où se trouve le ballon. Mais on peut aussi observer ailleurs. Un abaissement de température assez considérable, même de 15'\ ne fait que ralentir les mouvements sans les supprimer.

AUTRES BACILLES ANAEROBIES 89

Eu multipliant ces observations dans le courant d'une fermentation, on ne tarde pas à voir les mouvements devenir peu à peu moins vifs, et l'on peut assister au travail intérieur qui donne naissance à la formation de la spore. Frécpiemment alors, l'article primitivement cylindrique s'effile aux deux extrémités et parait se renfler au centre, comme si son protoplasma intérieur se concentrait en un point, pendant que le reste de Tarticle se vide et se flétrit. D'autrefois la spore apparaît à Lune des extrémités. Tout signe de fermentation disparait alors. Enfin, la spore s'isole par résorption du tissu environnant, et tombe au fond du vase à l'état de précipité inerte.

Ce précipité de fond, formé le plus ordinairement d'un mélange de spores et d'articles sans mouvements, peutil servir à ensemencer, sans nouveau passage au contact de l'air, une fermentation nouvelle? Pasteur s'en était assuré par un procédé compliqué, auquel il a substitué plus tard avec avantage l'emploi du tube de culture à deux branches dont nous nous sommes servis plus haut. Sa conclusion avait été que ce bacille supporte la vie anaérobie aussi facilement que d'autres espèces la vie aérobie. Il avait rattaché en outre cette conclusion à sa conception sur le caractère ferment que nous avons déjà discutée dans le courant de cet ouvrage et sur laquelle nous ne reviendrons pas. Bornons-nous à résumer ce qu'il avait découvert au sujet des autres propriétés physiologiques de ce bacille.

54. Produits de la fermentation butyrique, — Le produit principal de l'action de ce bacille sur le lactate de chaux est le butyrate de chaux. Pasteur a constaté qu'il se formait aussi, mais pas toujours, de l'alcool butylique. Il a noté lui-même que la composition des gaz qui se dégagent n'est pas toujours d'accord avec la composition des produits formés. Ainsi ce n'est pas toujours lorsqu'il y a le moins d'hydrogène qu'il y a le plus d'al-

00 CHAPITHE V

cool l)utylique, ainsi qu'on pourrait s'y attendre d'après les formules de transformation que nous connaissons, et môme dans les rares fermentations où l'hydrogène a fait défaut, il n'y a pas eu formation d^alcool butylique. D'un autre côté la proportion de l'acide carbonique à l'hydrogène semble sans cesse variable.

Il est curieux qu'en présence de ces variations, si analogues à celles que nous venons de rencontrer, et qui contrastaient si fort avec ce que ses études lui avaient appris jusque-là, Pasteur soit allé d'instinct à leur véritable origine, et les ait attribuées h un changement régulier des propriétés du vibrion, suivant son âge plus ou moins avancé et les conditions physiologiques et chimiques du milieu dans lequel il se développe. Il y avait une explication plus naturelle^ c'est que ce qu'il appelait le vibrion butyrique fut un mélange d'espèces, se développant inégalement suivant les circonstances. Il est difficile de dire aujourd'hui laquelle de ces deux interprétations était la vraie, l'espèce ayant été perdue. Mais l'histoire du Bacillua orthohutylicus nous montre qu'une môme espèce peut manifester toutes les variations relevées par Pasteur avec son ferment. Ce ferment n'est pas identique au Bacillm orthohutylicus^ puisque ce dernier ne fait pas fermenter le lactate de chaux. Mais il est sûrement de la môme famille et c'est pour cela que nous avons dû les rapprocher.

55. Fermentation du tartrate de chaux. — A la suite du ferment butyrique de Pasteur, nous placerons, à cause de son cai'actère purement anaérobie, un autre bacille, rencontré par Pasteur dans une fermentation spontanée de tartrate de chaux dans un milieu minéral, et qui, tant à raison de ses conditions de culture que des particularités de la physiologie, peut-être considéré comme une espèce pure.

AUTRES BACILLES ANAEROBIES 91

Dans une fiole disposée comme celle dont nous nous sommes servis plus haut, nous mettons :

gr-

Tartrate neutre de chaux, cristallisé et pur 100

Phosphate d'ammoniaque 1

— de magnésie 1

— de potasse 0,5

Sulfate d'ammoniaque 0,5

et on remplit la fiole, dont la capacité est de 2 litr. 5 environ, d'eau distillée pure, qu'on fait bouillir de façon à chasser tout l'air en solution. Nous avons déjà fait cette opération à propos de la fermentation butyrique, et nous n'insistons pas.

Quand la fiole est froide^ on y fait arriver quelques gouttes d'une fermentation de tartrate de chaux déjà en activité, puis on porte le tout à l'étuve. On voit^ les jours suivants, le liquide se troubler d'abord, puis redevenir et rester limpide, au point qu'on peut lire de l'écriture au travers de l'épaisseur de la fiole. En même temps commence, au voisinage du dépôt solide de tartrate de chaux, un travail particulier. Il se recouvre d'une couche d'un gris noirâtre, gonflée, d'aspect organique et gélatiniforme. En certains points se forment d'assez grosses bulles qui se dégagent si on agite un peu, en emportant quelques parcelles solides qui retombent vite sans troubler la limpidité du liquide. Dans les commencements, ce liquide redissout sur leur passage les bulles qui montent, parce qu'il n'est pas saturé, et ce n'est qu'au bout de quelques jours qu'il se forme, à l'extrémité de la courbure de la fiole, un dépôt permanent de gaz. Puis ce gaz s'accumule, se dégage^ et on reconnaît que c'est de l'acide carbonique pur^ fait que la dissolution complète qu'il éprouvait à l'origine pouvait permettre de prévoir.

Ce gaz carbonique est en très petite quantité avec les proportions de liquide et de tartrate que nous avons employées. En augmentant le volume de la fiole ou en dimi-

nuant la quantité de tartrate, on pourrait supprimer tout dégagement, conserver tout le gaz en solution, sceller même la fiole et y voir s'accomplir silencieusement, à l'ahri de Fair, sans dégagement gazeux apparent, sans aucun trouble dans la limpidité du liquide, la multiplication indétinie d'un ferment et la destruction d'une quantité théoriquement quelconque de tartrate de chaux.

Si on va chercher en etTet, à un moment quelconque, une prise d'essai dans la couche organique grise dont nous parlions tout à l'heure, on la voit formée de longs filaments, très grêles, n'ayant guère environ que Iij. de diamètre, mais dont la longueur, variable, peut dépasser 20pt. Une foule de ces longs vibrions rampent lentement avec un mouvement flexueux, et en montrant jusqu'à trois, quatre et cinq flexions. Ceux-là se rencontrent de préférence au voisinage des portions de tartrate non encore dissoutes. Là où la couche de tartrate a disparu, on trouve de préférence, reposant directement sur le verre de la fiole, des filaments identiques aux précédents, mais immobiles et un peu ponctués, comme formés d'une série de granulations un peu confuses. Tous ces vibrions, mobiles et immobiles, jeunes et vieux, sont enchevêtrés en amas. Il y a aussi des vibrions de même diamètre, plus courts et plus agiles que ceux qui sont en amas, parce qu'ils sont moins longs et plus libres de leurs mouvements, mais on ne les rencontre aussi qu'au voisinage immédiat de la couche de tartrate.

La limpidité du liquide et les différents aspects des vibrions que nous venons de signaler ont une même cause ; c'est au voisinage du dépôt que toute faction est concentrée. Le tartrate de chaux, étant à peu près insoluble dans feau, fait absolument défaut à l'intérieur du liquide. Le filament doit donc vivre au contact de son aliment carboné. La multiplication qu'il y subit produit ces enchevêtrements dont nous parlions tout à l'heure, qui gênent le mouvement des vibrions et les empêchent d'aller chercher

AUTRES BACILLES ANAEROBIES 93

de la nourriture ailleurs, lorsqu'ils ont fait disparaître celle qui était à leur contact immédiat ; de là l'aspect granuleux et épuisé de ceux qu'on a recueillis sur le verre de la fiole elle-même.

56. Produits de la fermentation. — Quand tout dégagement gazeux a cessé et quand le tartrate de chaux blanc a disparu, on trouve au fond du vase un dépôt de carbonate de chaux souvent cristallin, recouvert de la couche grise formée par les vibrions. L'odeur de ce dépôt est un peu putride. La réaction qui s'est produite est donc réductrice, et c'est sans doute à cela qu'est due la coloration grisâtre du dépôt. Les substances employées, si pures qu'elles soient, contiennent toujours des traces de fer qui se change en sulfure, et qui colore alors les matières minérales et organiques existant au fond du vase.

Le carbonate de chaux déposé et celui qui reste en solution dans le liquide chargé d'acide carbonique retiennent exactement la moitié de la chaux du tartrate employé. L'autre se trouve en dissolution dans le liquide, sous forme de sels organiques solubles, qui ont paru à M. Pasteur être un mélange d'un équivalent de propionate de chaux et de deux équivalents d'acétate.

L'équation suivante rend compte de la réaction.

3C'll' 0^ = 2C^irO'- + C'I1«0'+ 'iCO^ + 2H0.

Elle montre que dans la fermentation de 100 grammes de tartrate neutre de chaux, il doit se dégager 19 gr. 7 d'acide carbonique, c'est-à-dire exactement ce que M. Pasteur a trouvé par l'expérience. On peut donc l'accepter comme représentant le gros du phénomène.

Nous retrouverons ce ferment, ou quelques uns de ses congénères lorsque nous étudierons les maladies des vins, où l'acide tartrique fermente quelquefois. Nous ne l'envisageons ici qu'au point de vue théorique. C'est le premier bacille que nous rencontrons donnant uniquement de l'acide carbonique.

5*7. Fermentation butylique du sucre. — Dans CC groupe des ferments purement anaérol)ies nous plaçons encore, mais au dernier rang, un bacille à qui on pourrait contester ce caractère : c'est celui que Fitz a décrit sous le nom de ferment butylique des sucres. Fitz n'a jamais pris pom' l'ensemencer de précautions particulières de vie anaérobie. 11 a môme constaté que son bacille pouvait se développer dans des solutions aérées de lactate, de tartrate, de malate, de citrate de chaux, de lactate et tartrate d'ammoniaque, de glycérate de chaux, d'érythrite, sans les faire fermenter, tandis qu'il faisait fermenter dans les mêmes conditions les dissolutions de lactate de chaux, de glycérine et de mannite.

Ceci n'a rien de surprenant. Beaucoup de bacilles se comportent de même ; mais voici qui est plus curieux. La chaleur fait perdre à ce bacille son pouvoir ferment sur la glycérine, qui disparait après 3 minutes d'ébuUition et persiste après une minute. Le pouvoir ferment peut aussi être aboli lorsqu'on fait vivre le bacille en présence d'une quantité exagérée et suffisamment renouvelée d'oxygène.

On arrive au même résultat en cultivant toute une série de générations du microbe au large contact de l'air, dans un liquide nutritif, mais non fermentescible, par exemple dans une dissolution d'extrait de viande, étalée en couche mince au fond d'un matras à fond plat. En ensemençant le premier de ces matras, puis, quatre jours après, le second avec le premier, et ainsi de suite jusqu'au quatrième, rapportant ensuite de ce dernier la semence dans un liquide fermentescible, on a obtenu un développement, mais pas de fermentation. La même expérience a été faite avec du lactate de chaux et a conduit au même résultat.

Tous ces faits seraient certainement très curieux, car ils n'ont pas d'analogues, s'il était bien assuré que Fitz a eu affaire à des espèces pures. Mais comme son travail date d'une époque où cette purification était très difficile,

AUTRES BACILLES ANAEROBIES 98

et comme il ne dit pas qu'il s'en soit préoccupé, il est plus naturel de penser qu'il avait dans ses cultures un mélange de deux espèces très voisines comme forme, l'une aérobie, un peu plus résistante à la chaleur, et persistant seule lorsqu'on cultivait longuement le mélange au contact de l'air ; l'autre anaérobie, prenant possession du liquide lorsque la première l'avait débarrassé d'oxygène et que l'air ne pouvait pas s'y renouveler. C'est l'interprétation qui semble la plus naturelle et que nous accepterons. Nous ne prendrons donc dans le travail de Fitz que la partie relative aux fermentations avec dégagement gazeux. Ce que nous venons de dire indique qu'il y a quelque incertitude au sujet de l'espèce active. Mais les renseignements relatifs à la forme ont relativement peu d'importance ; ce qui est essentiel, c'est la fonction, et nous allons voir, que malgré tout, celle du hacillus biUylicus de Fitz est assez nettement précisée.

58. Ferment butylique de Fitz. — Ce ferment fig. 7, est un bacille assez large et assez trapu, ayant en moyenne 2;x de large et o à 6ij. de longueur. Mais ces dimensions

sont variables avec l'âge du microbe et la composition du liquide. Le bâtonnet jeune est un peu plus mince que lorsqu'il est vieux. Il est aussi plus effilé et plus long dans les liquides albumineux. Il devient plus large dans les liqueurs riches en glycérine. Dans un liquide en fermentation ses mouve. ments sont vifs et paraissent s'accompagner d'une rotation

% CllAl'lTllK V

autour (le Taxe. On ne le trouve jamais en masses zooglœiques.

Le contenu de la cellule est d'abord homogène et invisible, et reste longtemps tel dans les li([uides albumineux, ou dans ceux qui renferment de fortes proportions de glycérine, d'alcool éthylique ou d'alcool butylique ; mais d'ordinaire, les spores a apparaissent au bout d'un temps très court, quelquefois après deux ou trois jours de végétation seulement. Le contenu de la cellule qui, dans l'état de jeunesse, se colore en jaune par l'iode, se colore en bleu ou même en noir (|uand la spore va se former. Quelquefois la coloration a lieu dans toute la masse, quelquefois par bandes réparties au nombre de deux à six sur la longueur de l'article, quelquefois sur un point seulement.

Les spores a sont ovales, comme le représente la figure, et ont la largeur du bâtonnet lui-même. On leur trouve pourtant quelquefois des formes irrégulières, allongées ou recourbées. Quand on les ensemence dans du liquide neuf et qu'elles se développent, elles perdent leurs contours accusés, leur éclat, et deviennent triangulaires. Le mode d'apparition de l'être nouveau n'a pas été examiné de plus près.

Nous savons que ce bacille peut faire fermenter le sucre, la mannite et la glycérine, comme le hacillu^ orthohntylicus. de Grindjert, dont il diffère pourtant en ce qu'il ne s'attaque pas à l'amidon.

Les meilleurs milieux sont des solutions à 3 p. 100 de sucre, de mannite ou de glycérine, additionnées de 1/1000 d'extrait de viande, et d'une quantité suffisante de carbonate de chaux destiné à maintenir la neutralité de la liqueur. Il est bon de ne pas opérer sur des liqueurs plus concentrées. Non pas que le bacille n'y puisse vivre — l'expérience a montré qu'il pouvait faire fermenter des dissolutions à 20 p. 100 de glycérine — mais si la fermentation y commence, elle ne s'y termine pas, à cause de Inaction nocive de ses produits sur l'être qui en est